单细胞测序技术在男性不育病因研究及诊疗应用中的进展*

摘要:男性不育病因复杂,且精确诊疗困难,单细胞测序技术为男性不育相关研究提供了新的思路。该技术提供了单个细胞水平庞大的mRNA等组学信息,有利于分析男性不育疾病中的关键基因、重要信号通路新细胞类型、细胞分化方向及细胞相互作用等。近年来,单细胞测序技术在高促性腺激素型性腺功能减退症、克莱恩费尔特综合征、2型糖尿病、非梗阻性无精子症、梗阻性无精子症、勃起功能障碍等男性不育疾病中显示出较高的病因研究及精确诊疗应用价值。该文从病因机制、特殊细胞类型、潜在的诊断标志物及治疗靶点等角度对单细胞测序技术在男性不育疾病中的应用进行综述。     

人精子CatSper1 mRNA表达与精子活力的相关性研究

目的研究不同精子活力的人精子中精子特异性阳离子通道蛋白1(CatSper1)mRNA的表达差异,以及其与精子活力相关指标的相关性。方法分别收集少、弱精症患者精液标本和健康人对照精液标本各25份,用Trizol试剂提取精子中的总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测CatSper1 mRNA表达改变。结果少、弱精症组CatSper1 mRNA表达水平与健康人对照组相比,差异具有统计学意义[(0.54±0.01)vs(1.13±0.05),P<0.01]。CatSper1 mRNA表达与精子活率以及a+b级精子百分率之间呈显著正相关。结论人精子CatSper1 mRNA表达与人精子活力呈正相关。     

Annexin 5对人精子线粒体功能的影响

目的：观察膜联蛋白5（annexin 5）对人精子线粒体功能的影响。 方法：收集38例少弱精症患者精液标本。精子与annexin 5共温育,用罗丹明（Rh123）和碘化吡啶（PI）染色并用流式细胞术检测人精子线粒体功能。 结果：添加annexin 5组与对照组相比,线粒体功能良好的活精子百分率［（38.77±9.20）% vs （26.12±10.09）%,P<0.05］和线粒体荧光值［（509.72±45.02) vs (452.88±39.39),P<0.05］均有显著性升高。结论：体外添加annexin 5能增强精子线粒体的活性。     

StarD7与Wnt/β-catenin信号通路对Annexin 5刺激大鼠Leydig细胞睾酮分泌的影响

目的:研究StarD7以及Wnt/β-catenin信号通路促进睾酮合成的内在机制,探索睾酮合成的调控新途径。方法:用1 nmol/L的Annexin 5处理大鼠原代Leydig细胞24 h,化学发光法检测睾酮含量,利用RT-PCR和Westernblot方法分析StarD7和β-catenin在mRNA和蛋白水平上的表达变化,并利用免疫荧光法对β-catenin进行定位。结果:在Annexin 5的刺激作用下,与对照组相比,睾酮合成水平明显增加了176%[(7.83±0.32)vs.(21.6±1.1),P<0.05];在Annexin 5作用下,与对照组相比,StarD7在mRNA水平表达增加55%[(1.12±0.08)vs.(1.74±0.11),P<0.05],β-catenin表达增加48%[(1.15±0.08)vs.(1.70±0.05),P<0.05]。在蛋白水平上,与对照组相比,StarD7增加42%[(1.06±0.09)vs.(1.51±0.07,P<0.05)],β-catenin增加55%[(1.02±0.01)vs.(1.58±0.02),P<0.05],此外在Annexin 5作用下,β-catenin有入核积聚的趋势。结论:在Annexin 5作用下,StarD7和β-catenin的表达均有显著增加,且β-catenin有入核积聚的趋势,提示StarD7和β-catenin对Annexin 5刺激Leydig细胞睾酮的合成均有调控作用,该过程可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路,从而促进StarD7表达上升,最终导致睾酮合成增加。     

膜联蛋白5刺激大鼠Leydig细胞增殖过程中RhoA、 RockⅠ的表达

目的研究RhoA、RockⅠ促进大鼠Leydig细胞增殖的机制,探讨膜联蛋白5调控Leydig细胞增殖的新途径。方法用1 nmol/L膜联蛋白5处理原代培养大鼠Leydig细胞12、24、48 h后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,western blot检测RhoA和RockⅠ的蛋白质表达情况。结果 MTT法结果显示,1 nmol/L膜联蛋白5呈显著的时间依赖的促进Leydig细胞增殖作用,且24 h组细胞增殖能力与对照组差异最为显著(0.251±0.019 vs 0.207±0.009,t=4.380,P0.01);流式细胞分析发现,1 nmol/L膜联蛋白5作用于Leydig细胞,以作用24 h时对细胞周期的影响最为显著,可使G2+M期比例比对照组升高(12.24±0.84 vs 7.79±1.15,t=5.407),G0/G1期比例下降(67.61±0.37 vs 74.49±0.73,t=-14.64),P均0.01;western bolt结果表明,膜联蛋白5作用12、24、48 h后Leydig细胞RhoA表达结果分别为1.39±0.29、2.21±0.38、1.46±0.19,与0 h组结果 0.89±0.41比较,均有升高(t=2.028,P0.05;t=4.736,P0.01;t=2.550,P0.05);膜联蛋白5作用24、48 h后Leydig细胞RockⅠ表达结果分别为1.14±0.18、1.03±0.17,与0 h组结果 0.72±0.22比较均升高(t=2.944,P0.01;t=2.246,P0.05)。结论 RhoA、RockⅠ可能参与膜联蛋白5促进细胞周期G0/G1进程,最终促进Leydig细胞的增殖。     

微流控芯片在人类精子优选中的应用

目的 研究自制微流控芯片优选人类精子的效果.方法 自行构建微流控芯片装置.收集男性不育患者的精液样本:①分别置于无毒灭菌离心管与微流控芯片中1h、2h、3h、4h,比较各时间点两组精子活力的变化;②分别用微流控芯片优选精子40min、60min、80min,比较各时间点优选前后各项精子参数的变化;③分别用微流控芯片、上...     

Annexin 5对雄性SD大鼠应激损伤的保护作用

摘要：目的：研究膜联蛋白5（annexin 5,A5）对坐骨神经选择性损伤引起的慢性疼痛应激致雄性SD大鼠生殖损伤的保护作用。 方法：32只雄性SD大鼠随机分为4组,分别建立对照组、假手术组、手术组和手术＋A5组模型。手术＋A5组于术后第2天腹腔注射15 μg/kg 剂量的A5,其他实验组腹腔注射等量的pH 8.0 Tris-HCl,每日1次,连续21 d。分别测各组SD大鼠体重、称重睾丸和附睾,计算其脏器系数,并对附睾尾进行精子计数。HE染色观察睾丸组织结构变化。用化学发光法检测各组大鼠血清中睾酮浓度。 结果：手术组大鼠与对照组相比,睾丸系数、附睾系数以及精子相对计数均降低（P<0.05）;睾酮水平下降显著［（5.10±2.61） vs （22.40±4.30） mmol/L,P<0.01)］;病理切片见睾丸生精细胞与腔内精子数量明显减少。假手术组大鼠与对照组比,上述指标均无统计学差异。手术＋A5组与手术组比,精子相对计数与睾酮含量［（19.67±2.02） vs （5.10±2.61） mmol/L,P<0.01］均显著提高,其他参数均有不同程度的恢复,睾丸生精细胞与腔内精子数量减少程度显著恢复。 结论：A5对慢性疼痛应激引起的生殖损伤具有一定的保护作用。     

男性不育患者精液pH值与精液参数相关性分析

目的探讨不育患者精液pH值与精液参数的相关性,为男性不育症的诊断与治疗提供临床依据。方法将2014年4~9月就诊的122例男性不育患者予pH计检测精液pH值、计算机辅助的精液分析系统(CASA)分析精液常规参数、流式细胞仪分析精子DNA碎片指数(DFI)、ELISA检测精浆弹性蛋白酶,分析精液pH值与精液参数、DFI及精浆弹性蛋白酶等的相关性。结果不育患者精液pH值5.5~8.2,精液pH值与精子浓度呈正相关(r=0.244,P0.05),与精浆弹性蛋白酶也呈正相关(r=0.190,P0.05),而与精液量、前向运动精子百分率、精子活动率、DFI及正常形态精子百分率均无相关性(P均0.05)。结论不育患者精液pH值和精子浓度及精浆弹性蛋白酶均呈相关性,提示精液pH值的准确测定可能对男性不育的诊断和治疗有一定临床意义。     

Annexin5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中StarD7表达的影响

目的先前研究发现annexin 5刺激大鼠睾丸间质细胞后,3β-羟类固醇脱氢酶(3βbeta-hydroxysteroid dehydro-genase,3β-HSD)及睾酮水平都增加,推测annexin 5和睾酮之间可能存在某种内在联系。文中旨在研究annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌过程中的StarD7(START domain containing 7)表达的影响,探讨annexin 5影响睾酮分泌的机制。方法原代培养大鼠睾丸间质细胞,1nmol/L的annexin 5处理间质细胞24h,分别提取细胞总mRNA和总蛋白。RT-PCR检测StarD7的mRNA表达改变。Western blotting方法分析睾丸间质细胞中StarD7的蛋白表达变化。收取细胞爬片,利用免疫细胞化学的方法对StarD7在睾丸间质细胞中进行定位。结果与对照组相比,在mRNA水平上,加药组StarD7 mRNA的表达增加了44.5%(1.10±0.02 vs 1.59±0.09,P<0.05)。在蛋白水平上,加药组StarD7蛋白的表达增加了44.3%(1.49±0.10 vs 2.15±0.16,P<0.05)。StarD7主要定位在大鼠睾丸间质细胞的胞浆内,加药组的染色强度明显强于对照组。结论 StarD7在基因和蛋白水平均受annexin 5的调控,结合先前发现annexin 5可调控睾丸间质细胞睾酮合成的结果,提示annexin 5调控睾酮合成可能是通过调控StarD7的表达来实现的。