常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨

[目的]探讨运用聚合酶链反应．限制性片段长度多态性分析(IZCR-RFLP)和聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性。[方法]选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因，通过设计合适的通用引物进行PCR扩增，并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCF，分析。[结果]运用通用引物可以扩增出13属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因Hpa Ⅱ酶切产物的RFLP分析表明，不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱，利于进行细菌属的鉴定。不同种属食源性感染常见致病菌SSCF，图谱变异性更大，不利于进行种属间鉴别。对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明，不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱，SSCP图谱的变异性较大，这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别。[结论]PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力。     

转入IL-18 cDNA的鼻咽癌细胞在hu-PBL-SCID鼠中致瘤性的影响

为了探讨人白细胞介素 18(hIL 18)的表达对鼻咽癌细胞体内致瘤性的影响 ,我们构建了hIL 18的真核表达载体pcD NA3/hIL 18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE细胞 ;然后以转染阳性的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞接种到用健康人外周血白细胞免疫重建的SCID鼠 (hu PBL SCID鼠 ) ,观察成瘤情况。结果发现 ,所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL 18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL 18的含量为 (85± 10 )pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL 18的含量低于 5pg/ml。将转染阳性的细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种hu PBL SCID小鼠后连续观察 5 0d ,发现前者形成的肿瘤其生长速度明显慢于后者 ,其平均瘤重也有显著性差异 (P <0 0 0 1)。说明在体内hIL 18的表达能有效地抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用。     

转染肝癌总RNA的树突状细胞疫苗对肝癌的抑制作用及其机制

目的探讨转染肝癌细胞总RNA转染的树突状细胞(DC)疫苗抑制肝癌作用及其机制。方法采用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4联合培养6 d成小鼠骨髓来源不成熟DC(iDC),质脂体转染肝癌细胞系Hepa1-6 RNA入iDC,用LPS刺激后成为Hepal-6 RNA/DC疫苗,对照组为iDC组、LPS/DC组Saline组,以每只2×10~6个细胞腹腔注射免疫小鼠每周1次共3次,然后接种5×10~5 Hepal-6细胞,观察肿瘤生长情况、特异性CTL活性的测定以及抗体阻断实验。结果实验组Hepal-6 RNA/DC组肿瘤在第8周为(8．5±3．6)mm,而iDC组、LPS/ DC组、Saline对照组分别为(36．6±3．6)、(31．3±4．7)、(32．2±4．0)mm,与实验组比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。实验组脾细胞对Hepal-6细胞有特异性杀伤效应,而对肺癌LLC细胞无杀伤活性。所诱导的抗肿瘤效应细胞包括CD~(8+)、CD~(4+)T淋巴细胞。结论肝癌细胞的总RNA转染的DC肿瘤疫苗能诱导CD~(8+)、CD~(4+)T细胞免疫,是较有临床应用前景的肝癌免疫治疗方法。     

鼻咽癌细胞中表达的人白细胞介素18(hIL-18)对鼻咽癌患者外周血 CD8+T细胞细胞毒活性增强作用的研究

目的探讨人白细胞介素18在鼻咽癌细胞中的表达能否提高鼻咽癌病人外周血CD8+T细胞的杀伤活性以及作用途径.方法构建人白细胞介素18的真核表达载体[pcDNA3.1(-)/hIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE;以转染的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞为靶细胞,以鼻咽癌患者外周血的CD8+T细胞为效应细胞,混合培养12 h,用LDH释放法测定CD8+T细胞的细胞毒活性;用免疫组化法测定混合培养物中CD8+T细胞上Perlorin、Fas-L、Granzyme B的表达.结果所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL-18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL-18的含量为(85±10)pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL-18的含量低于5 pg/ml.将表达hIL-18的SUNE细胞与鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞混合培养12 h后,CD8+T细胞的细胞毒活性显著增强(P＜0.001),尤其是当效应细胞/靶细胞为101时,CD8+T细胞对转染的SUNE细胞的裂解率高达46.7%,而CD8+T细胞对未转染的SUNE细胞的裂解率仅为4.6%.免疫组化法表明,这种杀伤活性的增强与CD8+T细胞表达Perforin有关,而与Fas-L和Granzyme B途径无关.结论hIL-18能显著增强鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞的体外杀伤活性,这种杀伤活性与CD8+T细胞表达Perlorin有关.     

常见食源性感染致病菌属、种用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术鉴定探讨

[目的]探讨运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)和聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)进行食源性感染常见致病菌属种鉴定的可行性.[方法]选择细菌23S rDNA基因作为鉴别细菌属的靶基因,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增,并对13属食源性感染常见致病菌和5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析.[结果]运用通用引物可以扩增出13属食源性感染常见致病菌的23S rDNA基因HpaⅡ酶切产物的RFLP分析表明,不同种属的致病菌表现出不同的RFLP图谱,利于进行细菌属的鉴定.不同种属食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大,不利于进行种属间鉴别.对5种不同血清型大肠杆菌的23S rDNA基因扩增产物的RFLP和SSCP分析表明,不同血清型大肠杆菌表现出相似的RFLP图谱,SSCP图谱的变异性较大,这有利于进行血清型间鉴别甚至株间的鉴别.[结论]PCR-RFLP和PCR-SSCP具有应用于食源性感染常见致病菌种、属鉴别诊断的潜力.     

小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞T-bet表达的研究

目的 探讨体外转录法合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人淋巴细胞T-bet基因表达及功能的影响.方法 设计并合成4条siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3及siRNA-co),脂质体法转染淋巴细胞.转染后48 h收集转染后细胞,采用RT-PCR方法检测细胞T-bet mRNA的抑制率;酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞上清液中IL-4和IFN-γ水平;将淋巴细胞与人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)共培养检测淋巴细胞对ECV304增殖的抑制作用.结果 转染后48h半定量RT-PCR的检测显示siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3转染后的淋巴细胞T-bet表达抑制率分别为(72.50±1.01)%、(5.40±0.63)%和(30.90±0.90)%,以siRNA-1转染后的淋巴细胞T-bet表达抑制作用最强(P＜0.05),其细胞上清液中IL-4水平最高,而IFN-γ的水平最低(P＜0.05),siRNA-1转染淋巴细胞对人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)增殖的抑制作用低于siRNA-2及siRNA-3.结论 siRNA可特异性抑制淋巴细胞T-bet基因的表达,从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受中应用提供了理论和实验基础.     

反义人IL-10和反义病毒性IL-10抗鼻咽癌细胞成瘤效应的研究

目的:探讨反义人IL-10和反义病毒性IL-10抑制鼻咽癌细胞成瘤的效果。方法:扩增及克隆hIL-10 cDNA和 vIL-10基因,构建反义hIL-10和反义vIL-10双价真核表达载体pcDNA3/AS hIL-10 AS vIL-10,转染鼻咽癌细胞株SUNE。将转染阳性的SUNE细胞克隆和未转染的SUNE细胞接种SCID小鼠和经健康人外周血白细胞免疫重建的SCID小鼠（hu-PBL-SCID鼠）,观察成瘤效应。结果:ELISA法测得未转染SUNE细胞培养上清液中IL-10和vIL-10的总含量为242±23pg/ml,而转染阳性的SUNE细胞培养上清液中hIL-10和vIL-10的总含量仅为22±6pg/ml。在SCID鼠体内,vIL-10和hIL-10的表达与否,并不影响鼻咽癌细胞的成瘤活性,但在hu-PBL-SCID鼠体内,抑制vIL-10和hIL-10的表达则可明显抑制鼻咽癌细胞的成瘤作用。结论:反义人IL-10和反义病毒性IL-10可显著抑制鼻咽癌细胞在血hu-PBL-SCID鼠体内的成瘤作用,鼻咽癌组织表达vIL-10和hIL-10的确与鼻咽癌免疫耐受有关。     

HepG2细胞表达蛋白HCVC体外活化肝星状细胞的研究

目的舰察HCV核心蛋白对肝星状细胞活化及合成细胞外基质的影响,为进一步研究HCV核心蛋白的致肝纤维化机制提供实验依据。方法采用双抗体夹心ELISA检测HepG2一HCVC细胞株培养液中TGF-{31的表达。用HepG2-HCV-C和HepG2两株细胞培养5d的上清液培养人肝星状细胞系LX2细胞,同时用DMEM培养LX一2细胞作对照,分别制备细胞爬片,采用免疫细胞化学染色（ICC）法检测I,X～2细胞中人a平滑肌肌动蛋白（a—SMA）、IV型胶原（ColIV）、结缔组织生长网子（CTGF）和纤维连接蛋白（FN）的表达;采用双抗体夹心EI．ISA检测LX-2细胞1～6d培养上清液中人ColIV、Ⅲ型前胶原肽（PⅢNP）、透明质酸（HA）和人层粘连蛋白（LN）的表达。所有数据采用SPSSll．0统计软件进行统计分析。结果双抗体夹心El。ISA检测HepG2-HCV-C细胞1～6d培养液中的TGFp1量为（110．00±111．45）pg／ml～（935．00±21．36）pg／ml,Helc）G2细胞为0～（124．16±11．81）pg／ml,差异有统计学意义（F一21984．81,P〈0．01）。1CC检测用HepG2-HCVC上清液培养的I．X～2细胞d—SMA、ColⅣ、CTGF和FN均为弥漫阳性,细胞染成深褐色;用HepG2培养的LX-2细胞呈局灶性棕黄色,DMEM培养的LX2细胞染色阴性。ELISA检测LX-2（HepG2-HCVC）组CollV、HA、LN和P11INP的值均显著高于LX2（HepG2）组和LX-2（DMEM）组（均P〈0．05或P〈0．01）。结论HCVC蛋白能上调TGF-β1的表达,表达C蛋白的细胞系能促进LX-2细胞多种细胞外基质（ECM）的合成。提示HCVC蛋白可能通过活化肝星状细胞,参与肝纤维化形成中多种ECM合成的调控。     

丙型肝炎病毒核心蛋白引发肝脂肪变性机制的研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种主要经血液传播的肝炎病毒,是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要原因之一.已经证明,HCV感染引发的肝脏脂肪变性与慢性丙型肝炎患者的肝脏纤维化及对抗病毒治疗的疗效应答有显著的影响,因此HCV核心(Core,C)蛋白引发肝脏脂肪变性机制的研究对探索HCV感染治疗新方法,乃至最终控制HCV感染,都有十分重要的意义.     

广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析

目的 通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒(DEN-1)蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析,了解各流行株之间的遗传差异及进化关系,追踪其可能的传染来源.方法 应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因,克隆到pGEM-T Easy载体,转化DH5α宿主菌,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定.测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析,并绘制基因系统发生树.结果 4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485 bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性为91%～98%,推导的氨基酸序列同源性为96.0%～99.2%.广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异.结论 通过对登革1型病毒E基因的进化分析,GZ01/95、GZ01/02和GZ01/04这3株同属于基因型Ⅳ,而GZ17/06属于基因型Ⅰ.1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚,而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关.2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关.