蛋白质不稳定性及其分析技术

蛋白质不稳定性包括两种形式：化学不稳定性和物理不稳定性，这两种不稳定性可采取不同的分析技术。了解蛋白质不稳定性及其分析技术在生物工程药物的质量控制中有十分重要的作用。     

损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的作用

背景：损伤胰腺提取液含有胰腺再生过程的特异性生长因子，能够促进β细胞系增殖和胰岛素分泌，可能有助于胰岛再生和细胞分化。 目的：观察损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-06/2007-03在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。活化素A、视黄酸、胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品，链脲菌素为Sigma公司产品。 方法：大鼠腹腔注射链脲菌素，2 d后血糖浓度超过10 mmol/L时取其胰腺组织，在含有胰蛋白抑制剂的磷酸盐缓冲液中制备匀浆，2次离心后取上清，即为损伤胰腺提取液。采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，当传代细胞生长至70%~80%融合时，随机分为4组：对照组以体积分数为0.02的胎牛血清的低糖DMEM培养11 d；活化素A+视黄酸组以活化素A、视黄酸各自诱导24 h，再以碱性成纤维生长因子、尼克酰胺、尼克酰胺+exendin 4各自诱导3 d；活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组在前组基础上添加损伤胰腺提取液；损伤胰腺提取液组单纯以损伤胰腺提取液诱导11 d。 主要观察指标：应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测，ELISA法检测细胞胰岛素的分泌水平。 结果：活化素A+视黄酸组、活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组有较多的胰岛素阳性反应细胞出现，且后者形成的胰岛样结构较前者大而多；损伤胰腺提取液组可见较少的胰岛素阳性反应细胞及胰岛样结构。各诱导组均检测到胰岛素1 mRNA的表达，培养上清中均可检测到胰岛素的分泌，且活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组胰岛素分泌水平>活化素A+视黄酸组>损伤胰腺提取液组（P < 0.05）。对照组各项指标均呈阴性表达。 结论：基于前期活化素A、视黄酸及其他成熟因子的诱导方案基础上，损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，能够提高诱导分化效率。     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。设计、时间及地点：单一样本实验，于2007—04／2008—01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。材料：5份羊水标本来自孕16～22周流产孕妇自愿捐献。方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h，细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72．88％、5．77％、21．35％；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。     

活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛素分泌细胞

背景：胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的最有效的方法。然而，供体组织来源的匮乏限制了其应用。近来干细胞研究的进展表明，干细胞疗法可能解决这一问题。 目的：采用活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞分化，探讨骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性。 设计：随机对照实验。单位：解放军军事医学科学院生物工程研究所。材料：实验于2004-11／2005-06在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。Sprague-Dawley大鼠6只，雄性，体质量150-160g，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。 方法：无菌抽取大鼠股骨骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。传代细胞随机分为4组，高糖组、活化素A和视黄酸组、β-巯基乙醇组和阴性对照组。分别采用含有高糖、活化素A和视黄酸、β-巯基乙醇等刺激因素的条件培养基进行诱导。应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测。 主要观察指标：检测胰岛素和胰高血糖素，以及胰岛素1mRNA的表达。 结果：骨髓间充质千细胞经过诱导后，①在高糖诱导组中，有散在的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现。②活化素A和视黄酸组及β-巯基乙醇组有较多的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现，而且这些细胞形成类似胰岛样的结构。③高糖组，活化素A和视黄酸组，β-巯基乙醇组均可见胰岛素lmRNA的表达。④阴性对照组未见有胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现以及胰岛素1mRNA的表达。 结论：实验建立的一种基于活化素A和视黄酸及其他成熟因子的一种诱导方案，成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素阳性反应细胞，并且形成类似胰岛样结构，但其诱导效率有待进一步提高。     

脐血造血干／祖细胞研究进展

脐血和骨髓均富含造血干／祖细胞，但二者在造血干／祖细胞的含量上存在差别。脐血中各CD34^ 细胞亚群有着独特的免疫表型。脐血造血干／祖细胞能在体外扩增，扩增后的CD34^ 细胞能在SCID小鼠体内造血，由脐血CD34^ 细胞可以生成淋巴细胞和内皮细胞。脐血造血干／祖细胞移植与骨髓造血干／祖细胞移植在患者的生存率、复发率及移植免疫排斥等方面均具有可比性，有着极大的潜在价值。     

用微量细胞病变抑制法观察三种天然人干扰素的协同抗病…

用微量细胞病变抑制法观察天然人α，β，γ干扰素（ｎｈｕＩＦＮ－α，β，γ）在体外诱导ＨＥｐ－２细胞的抗病毒协同作用。ｎＨｕＩＦＮ－γ和ｎＨｕＩＦＮ－α或ｎＨｕＩＦＮ－β共同作用于ＨＥｐ－２细胞表现为抗病毒协同增强效应；ｎＨｕＩＦＮ－α和ｎＨｕＩＦＮ－β共同作用于ＨＥｐ－２细胞只表现为抗病毒协同相加效应。实验结果表明：ｎＨｕＩＦＮ－γ和ｎＨｕＩＦＮ－α或ｎＨｕＩＦＮ－β的抗病毒协同增强作用，与不同干     

褪黑素对老化卵母细胞体外发育能力的改善效果评价

目的探讨体外培养阶段(IVC)添加褪黑素(MT)对卵母细胞老化引起发育受损的改善效果。方法采用不同浓度的过氧化氢(H_2O_2)处理小鼠MII期卵母细胞诱导老化,浓度分别为0(对照组)、10、50、100、150μmol/L,体外受精(IVF)后统计各组二细胞率、囊胚形成率,检测老化卵母细胞的线粒体活性及丰度(Mitotracker Red、JC-1)、活性氧(ROS)水平、线粒体拷贝数等指标;在100μmol/L H_2O_2处理条件下,老化卵母细胞在IVF后的培养阶段分别添加不同浓度褪黑素(10-5、10-7、10-9 mol/L),统计二细胞率、囊胚率,并且分别检测各组获得囊胚的细胞数及凋亡率。结果不同浓度H_2O_2诱导卵母细胞老化后,囊胚发育率随H_2O_2浓度的升高而降低,50μmol/L和100μmol/L H_2O_2组囊胚形成率分别为(26.27±0.06)%和(28.46±3.45)%,相比对照组的(34.90±1.77)%显著降低,差异有统计学意义(P0.05);在H_2O_2诱导老化卵母细胞中,100μmol/L、150μmol/L H_2O_2浓度时,ROS水平相比对照组显著升高,差异具有统计学意义(P0.05);而活性线粒体的丰度及拷贝数呈现下降趋势,膜电位呈上升趋势,但相比对照组无显著性差异(P0.05);100μmol/L H_2O_2处理诱导卵母细胞老化后,在培养液中添加10-9 mol/L褪黑素组与老化对照组相比,囊胚率[(29.42±2.39)%vs.(20.87±4.12)%]、囊胚细胞数(39.36±9.78vs.37.91±4.25)均显著升高,凋亡率显著下降(2.57%vs.3.18%),差异均有统计学意义(P0.05);并且这些指标均达到与未经老化处理组的相似发育水平。结论老化卵母细胞体外受精后发育率和发育质量偏低的现象,可以通过在受精后体外培养阶段添加褪黑素得到改善。     

不稳定蛋白质的分离纯化

随着生物技术的发展，制备高纯度和活性的药物和研究用蛋白质越来越重要，在分离纯化中，特别是不稳定蛋白的分离纯化，需要控制影响蛋白质稳定性的因素和采用分离纯化新技术，以确保目标蛋白的纯度的高活性。     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。 目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。 设计、时间及地点：单一样本实验，于2007-04/2008-01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：5份羊水标本来自孕16~22周流产孕妇自愿捐献。 方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。 结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h；细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72.88%、5.77%、21.35%；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。 结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。     

用微量细胞病变抑制法观察三种天然人干扰素的协同抗病毒作用

用微量细胞病变抑制法观察天然α，β，γ干扰素（ｎｈｕＩＦＮ－α，β，γ）在体外诱导ＨＥｐ－２细胞的抗病毒协同作用。ｎＨｕＩＦＮ－γ和ｎＨｕＩＦＮ－α或ｎＨｕＩＦＮ－β共同作用于ＨＥｐ－２细胞表现为抗病毒协同增强效应；ｎＨｕＩＦＮ－α和ｎＨｕＩＦＮ－β共同作用于ＨＥｐ－２细胞只表现为抗病毒协同相加效应。实验结果表明：ｎＨｕＩＦＮ－γ和ｎＨｕＩＦＮ－α或ｎＨｕＩＦＮ－β的抗病毒协同增强作用，与不同干扰素（ＩＦＮ）处理ＨＥｐ－２的顺序及ＩＦＮ的浓度比例有关；ｎＨｕＩＦＮ－γ与ｎＨｕＩＦＮ－α的抗病毒协同增强作用是细胞接受ＩＦＮ作用后早期即发生的现象。