红色荧光金葡菌假体感染临床株的构建

目的建立红色荧光标记金黄色葡萄球菌(金葡菌)假体感染(PJI)临床株，探究工具菌的生物学特性及和初步应用可行性。 方法通过分子克隆手段构建mCherry红色荧光表达质粒，通过电转化和噬菌体转导构建红色荧光标记金葡菌PJI临床株。通过生长曲线检测，体外成膜和生物量分析和荧光强度测量鉴定工具菌生物学特性。采用RAW264.7细胞株、工具菌建立共培养模型。采用该模型示踪不同锌离子浓度处理的巨噬细胞对于荧光PJI金葡菌吞噬能力。使用独立样本t检验、重复测量方差分析对定量数据进行统计。 结果使用Gibson系统成功构建了荧光表达质粒pRMC2-pts-mCherry，并且使用噬菌体Phage11将该质粒成功导入金葡菌假体感染临床株ST1792。较之于野生株ST1792，荧光金葡菌ST1792-pRMC2-pts-mCherry两者的生长曲线没有统计学差异(F＝0.012，P>0.05)。在0.5%葡萄糖胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSBG)内，两者的生物膜光密度(OD)值分别为(3.700±0.003)和(3.715±0.042)(t＝0.6056，P>0.05)；10%滑液中生物膜OD值为(3.682±0.084)和(3.648±0.095)(t＝0.474，P >0.05)。使用动物活体成像系统(IVIS)检测荧光强度，24 h荧光强度为(1.95± 0.04)、48 h荧光为(1.94±0.13)、72 h荧光强度为(1.95±0.04)，荧光强度72 h稳定(F＝2.944，P>0.05)。通过荧光显微镜观察以及菌落形成单位(CFU)计数评价发现，使用锌离子浓度30～60 μmol/L不含抗生素的培养基处理RAW264.7 24 h，可以促进其吞噬金葡菌，其中30 μmol/L吞噬率为(44±4)%(t ＝4.75，P<0.01)、45 μmol/L吞噬率为(45±6)%(t＝4.086，P<0.05)、60 μmol/L离子处理的巨噬细胞，其吞噬率为(38±4)%(t ＝4.786，P <0.01)。 结论本研究成功构建红色荧光临床PJI金葡菌，并验证其用于PJI相关体外吞噬研究的可行性。     

葡萄球菌假体周围关节感染动物模型的研究进展

假体周围关节感染(periprosthetic joint infection,PJI)是人工关节置换术后最严重的并发症之一,导致灾难性的临床后果。近年来,尽管加强了术中无菌技术和预防性抗生素的应用,但感染率在初次关节置换中仍有0.5%~1.2%,而翻修中约为3%~5%[1]。对于多数假体感染的患者而言,都要接受再次手术,忍受灌洗、清创、移除假体甚至截肢的巨大痛苦;对医院而言,感染病例的花费约是未感染病例的五     

大肠杆菌－类中性粒细胞－金属片共培养模型的构建

目的建立稳定发光的类中性粒细胞－大肠杆菌－金属片双荧光三相共培养动态模型，并研究其可行性和应用价值。 方法抽提pUC57-mCherry质粒，电转入大肠杆菌临床株ST131，构建稳定发光的ST131-mCherry大肠杆菌。通过活体成像(IVIS)系统对构建的ST131-mCherry大肠杆菌进行筛选。通过稀释涂板法比较ST131-mCherry与ST131的生长曲线，通过结晶紫染色比较ST131-mCherry与ST131的生物膜形成能力。将ST131-mCherry与钛片共培养，荧光显像观察不同时间点成膜情况，并通过超声震荡稀释涂板法对钛片表面生物膜计量。采用全反式维甲酸(ARTA)诱导HL60-eGFP细胞分化为类中性粒细胞。使用诱导分化的HL60-eGFP细胞、ST131-mCherry与金属片共培养，构建双荧光三相共培养模型，通过荧光显微镜观察以及稀释涂板计数评价不同金属表面的类中性白细胞抗菌能力。使用独立样本t检验对OD值和活菌数等定量数据进行统计。 结果经临床株筛选，质粒电转获得红色荧光菌株"ST131-mCherry"，在体外连续培养48 h，ST131-mCherry可稳定发光。ST131-mCherry与野生株ST131相比，两者的生长曲线没有统计学差异。在胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，ST131与ST131-mCherry生物膜结晶紫染色490nm的OD值分别为(1.04±0.06)和(1.04±0.05)(t＝0.890, P>0.05)；在0.5%葡萄糖胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSBG)中，分别为(1.55±0.06)和(1.49±0.17)(t＝0.822, P>0.05)；在10%滑液(SF)中，分别为(2.13±0.16)和(2.124±0.13)(t＝0.833, P>0.05)。ST131-mCherry可以在钛片表面成膜，其荧光强度随着成膜量的增加而变强。诱导分化的HL60-eGFP细胞、ST131-mCherry与钛片或钽片共培养结果显示，经过60 min的共培养，钽金属体系内的HL60-eGFP细胞能够吞噬更多的ST131-mCherry大肠杆菌，钛片体系和钽片体系内细菌存活率分别为(33±2.5)%和(15.7±1.2)%(t＝10.47, P<0.01)。 结论本研究成功构建了大肠杆菌－类中性粒细胞－金属片双荧光三相动态共培养模型，该模型是1种实用的PJI相关抗菌材料体外研究方法。     

稳定生物发光金葡菌临床株假体周围关节感染动物模型的构建

目的建立稳定型生物发光临床株金黄色葡萄球菌假体周围关节感染(PJI)动物模型并探讨其可行性及应用价值。方法应用噬菌体Phi11侵染带Lux发光基因的标准菌株BD1652,并通过噬菌体转导将Lux基因导入PJI临床菌株金葡菌ST1792基因组DNA,进而构建成稳定型生物发光临床菌株ST1792-Lux。通过抽纸牌,将10只健康BALB/c小鼠随机均分为实验组和对照组,使用克氏针作为两组模型动物的左膝关节假体。术中实验组左膝关节内注入10μl(105CFU)ST1792-Lux菌液,对照组注入等量0.9%氯化钠溶液,术后1、3、7、14 d,采用活体成像系统(IVIS)检测生物发光强度随时间变化;并于术后2周观察小鼠左膝关节病理学变化。以非配对t检验对ST1792-Lux和ST1792的生物膜形成能力和同一时间点实验组与对照组小鼠左膝平均生物发光强度进行比较分析。结果经临床株筛选,噬菌体Phi11转导获得生物发光菌株"ST1792-Lux",无抗生素筛选条件下连续传代培养48 h,ST1792-Lux稳定发光;Lux基因重组于ST1792基因组DNA内,较之野生株ST1792,ST1792-Lux在生长能力和不同培养条件下成膜能力(tTSB=1.16,1.29;tTSBG=0.38,0.31;P均0.05)方面差异无统计学意义。IVIS检测示,术后每个时间点(1、3、7和14 d),实验组较对照组的左膝平均生物发光强度均明显增高(t=9.13,10.72,14.48,7.46;P均0.05)。结论本研究成功建立了稳定生物发光临床株S.aureus PJI动物模型,其稳定性高、重复性好,可用于临床株S.aureus PJI的致病分子机制和各种干预措施有效性的体内研究。