树突状细胞负载肝癌抗原肽疫苗体外诱导特异性免疫学反应的研究

目的：研究树突状细胞(dendritic cell，DC)负载肝癌抗原肽EPVTKAEML体外诱导特异性CTL的能力及其抑癌效果。方法：用顺序特异引物聚合酶链反应技术(PCR—SSP)选择HLA—B7表型供者，从脾组织中分离、培养DC-EPVTKAEML特异性CTL。用^51Cr释放法检测CTL的杀伤活性，并用抗HLA-1分子单抗(mAb)进行杀伤抑制实验。结果：找到4例HLA-B7杂合子供者，用DC负载HLA-B7限制的抗原肽EPVTKAEML可诱导特异性CTL反应，对肝癌细胞HHCC有较强的杀伤作用。结论：DC负载抗原肽EPVTKAEML在体外可诱发较强的特异性免疫反应。     

液质联用分析肝癌细胞HLA Ⅰ类分子递呈的抗原肽

0 引言HLA-抗原肽是抗原经过抗原递呈细胞(APC)加工后,由HLA分子递呈给T细胞抗原受体(TCR)的短肽. 寻找能够为T细胞所识别的HLA结合肽对于肿瘤免疫学研究及肿瘤有效防治具有重要的理论意义和应用价值,许多国家都在致力于这一领域的研究. 细胞HLA-抗原肽含量很少,分子量很小,难于纯化和测序,是免疫学研究的一个难点. 我们应用肝癌细胞膜酸洗技术及高效液相色谱与质谱联用技术首次分析和鉴定了一条为HLA-A2递呈的肝癌抗原肽.     

肝癌细胞实验室大量培养的方法及其质控

目的:探讨以提取肝癌抗原肽为目的的肝癌细胞实验室大量培养方法及其质量控制。方法:先利用普通培养瓶在CO_2孵箱中进行少量培养,再接种到10L转瓶进行旋转培养;FCM检测MHC-Ⅰ类抗原表达。结果:细胞数增加1～9倍,不仅保持了MHC-Ⅰ类抗原的表达量,而且,培养细胞质量高、好。结论:建立了用于制备肝癌抗原肽的肝癌细胞实验室大量培养方法。     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

微波固化保肢术后成骨肉瘤患者红细胞免疫功能的变化

研究微波固化保肢术提高患者生存率的免疫学机制。方法应用色散比浊法检测患者血清Ｃ３、Ｃ４含量,应用红细胞Ｃ３ｂ受体花环、免疫复合物花环及直接肿瘤花环检测红细胞免疫功能。     

吉非替尼治疗前后肺腺癌患者血清蛋白质谱的变化

背景与目的 表皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治疗晚期NSCLC患者最终都会出现耐药.本研究目的 是检测耐药前后血清蛋白质谱的变化,探索可能用于预测TKI治疗后出现耐药的血清预测因子.方法 收集9例晚期NSCLC患者接受吉非替尼(gefitinib)治疗前后自身配对的血清样本20份,即入组口服吉非替尼前及临床评价为疾病进展前两周所采集的外周血血清.所有的患者对吉非替尼的最佳总疗效评价为疾病稳定或部分缓解.所有样本用弱阳离子微珠进行预分离后.在Bruker AutoflTM基质辅助激光解析离子化-时间飞行质谱仪(MALDI-TOF-MS)上进行血清蛋白质谱检测.以ClinProTools(Version:2.1)软件进行数据采集分析.结果 自身配对分析发现有7个血清蛋白质表达水平在肺癌患者耐药前后的血清中有统计学差异.该7个血清蛋白质谱峰为3 242.09、8 690.36、2 952.64、3 224.04、1 450.51、1 887.8及3 935.73(m/z).有3个血清蛋白(3 242.09、2 952.64及3 224.04)在耐药血清中下调,其余4个血清蛋白(8 690.36、1450.51、1 887.8及3 935.73)则出现上调.结论 特定的血清差异蛋白可能与吉非替尼治疗有效患者在治疗过程中出现耐药相关.这些差异蛋白的特性及其与吉非替尼治疗耐药的分子机制有待进一步研究.     

KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞杀伤活性和TCR VβT细胞增殖的研究

【摘　要】　目的　了解急性髓系白血病KG1a细胞体外诱导人外周血T细胞的特异性细胞毒作用和T细胞受体(TCR) Vβ谱系表达和克隆性情况。方法　分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,建立TCR Vβ谱基因扫描技术,并用其检测5例健康个体T细胞克隆表型。采用混合淋巴细胞/肿瘤细胞培养方法,以照射后的KG1a细胞作为刺激原体外诱导外周血单个核细胞增殖,应用LDH释放法检测不同效靶比时诱导前后T细胞杀伤KG1a细胞的活性,同时利用基因扫描技术分析诱导后TCR Vβ亚家族的克隆性增殖特点。结果　基因扫描显示5例健康人全部TCR Vβ谱型均呈高斯(钟型)分布,各亚家族表达频率接近,但呈现不同的多态性和长度分布。KG1a细胞可以诱导出呈单克隆、寡克隆或寡克隆趋势生长的亚家族T细胞,并具有特异性识别和杀伤KG1a细胞的功能。结论　KG1a细胞在体外可诱导T细胞呈克隆性增殖,此优势增殖的克隆性T细胞具有特异性细胞毒作用,对KG1a细胞具有选择性杀伤作用。     

PRL-2基因转染对肝细胞增殖及细胞周期的影响

目的：研究PRL-2基因对肝细胞增殖和细胞周期的影响。方法:采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至正常永生化肝细胞系CL1中，G418筛选阳性克隆。应用实时荧光定量聚合酶链反应、Western印迹和免疫组化分析PRL-2在阳性细胞的表达及蛋白定位，MTT法检测细胞的群体倍增时间，流式细胞仪检测细胞周期变化，Western印迹分析细胞周期素A、D1、E以及周期蛋白依赖激酶抑制因子p16、p21WAF1及p27Kip1的变化,实时荧光定量聚合酶链反应检测p21WAF1mRNA的变化。结果: 成功构建PRL-2真核表达载体pcDNA3-PRL-2。脂质体转染细胞经过G418筛选后,获得稳定表达PRL-2的细胞亚系PRL-2-CL1。经实时荧光定量PCR、Western印迹和免疫组化证实,PRL-2-CL1细胞系PRL-2基因及蛋白表达水平高于对照组，流式细胞仪检测细胞周期S期细胞比例明显增高，MTT法检测细胞群体倍增时间缩短。Western印迹及实时荧光定量聚合酶链反应显示p21WAF1在转染后较对照组明显降低，细胞周期素A、D1、E及p16、p27Kip1无明显变化。结论: 重组PRL-2真核表达载体构建正确,并在永生化肝细胞中获得稳定、高效表达。PRL-2基因具有促进细胞增殖的作用，这种作用与其降低p21WAF1蛋白含量相关。     

超声造影剂促进野生型p53基因转染抑制大鼠卵巢癌生长的实验研究

目的 探讨超声辐照造影剂微泡促进野生型p53基因转染进而抑制大鼠卵巢癌生长的有效性。方法构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，将40只卵巢癌荷瘤大鼠分成4组。第1组瘤体内注入造影剂微泡和野生型p53质粒混合物，并用超声辐照大鼠腹部瘤区；第2组注入裸质粒后予以超声辐照瘤体；第3组注射超声造影剂和基因混合物后无超声辐照；第4组仅注入裸质粒而无超声辐照。每组进行基因转染每周1次，共进行8次。2月后用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测野生型p53 mRNA在卵巢癌组织中的表达，Western Blot检测野生型p53基因蛋白表达。结果成功构建野生型p53真核质粒表达载体pcDNA3．1＋／p53，埋线法建立卵巢癌动物模型；用超声波辐照微泡促进基因转染后见p53基因转录及表达。第1组p53 mRNA的表达明显增强，高于其他3组，约是第2组的2．65倍，第4组的5．95倍。第2组高于未行超声辐照组，是第4组的2．23倍。第3、4组基因表达差异无统计学意义；Western Blot分析示p53基因蛋白表达的差异模式基本同mRNA，即第1组p53 mRNA的表达增强，高于其他3组，约是第2组的1．75倍，第4组的3．13倍；第2组高于未行超声辐照组，是第4组的1．79倍；第3、4组基因表达差异无统计学意义。结论瘤体内注射造影剂微泡和野生型p53质粒混合物后行超声辐照，可明显增加质粒基因在癌瘤组织中的导人及表达，超声联合造影剂微泡可作为卵巢癌基因治疗中促进基因转移的辅助方法。     

HRM法检测结直肠癌组织KRAS基因密码子12和13点突变

目的 建立HRM法检测大肠癌患者肿瘤组织KRAS(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变的方法 .方法 采用HRM法对含不同比例KRAS基因突变型质粒的系列混合样本进行检测,以评价其灵敏度.应用HRM法检测60份大肠癌患者新鲜肿瘤组织KRAS基因密码子12和13的突变状况,并与直接测序法的结果 进行比较分析.结果 HRM法只需在PCR结束后直接运行高分辨熔解,即可获得检测结果 .HRM法可检出系列混合样本中突变型质粒比例为10%的突变,其检测灵敏度达10%.HRM法从60份大肠癌患者组织标本中,检出17份KRAS基因密码子12或13突变(28.3%);直接测序法检出15份(25.0%)突变,2份未检出KRAS基因突变.HRM法检测的敏感度为100%(15/15),特异度为96%(43/45).结论 HRM法在筛选大肠癌标本的KRAS基因突变类型时,具有操作简便、快速、灵敏,单管避免污染等优点,完全符合临床个体化治疗的要求,值得推广.