Human Annexin Ⅴ在不同胎盘中的表达的定量分析

目的观察人膜联蛋白Ⅴ(Human Annexin Ⅴ,HAⅤ)在乙肝病毒感染胎盘、正常中、晚孕胎盘及早孕绒毛中的表达并探讨其意义.方法用SP法检测HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘、HBV血清标志物阴性的正常早孕、中孕和足月胎盘各20例HAⅤ的表达、分布并进行定量分析.结果中孕、足月胎盘和HBV感染的胎盘组织中HAⅤ呈不均一的棕黄色颗粒状染色,泛存在于胎盘组织各类细胞胞浆、胞膜和核膜上.滋养细胞呈强阳性染色,绒毛间质细胞和毛细血管内皮细胞呈弱阳性染色.早孕绒毛HAⅤ棕黄色颗粒主要分布于外层滋养细胞的胞浆、胞膜和核膜上,最内层滋养细胞和间质偶见表达;比较HBV感染组和正常足月组胎盘HAⅤ表达的量,前者的平均灰度比后者明显增高,差异具有显著性(P＜0.01),中孕组与足月组HAⅤ表达的量没有差别(P＞0.05),早孕和中孕组、足月组HAⅤ表达的量的比较,前者显著低于后两者(P＜0.05).结论HAⅤ可能作为受体介导了HBV对胎盘的感染.     

激光捕获显微切割结合RNA线性扩增技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用

目的当对有间质细胞混杂的膀胱移行上皮细胞与膀胱移行细胞癌进行基因差异表达分析时,激光捕获显微切割技术(lasercap-turemicrodissection,LCM)是不可缺少的,然而从LCM所得的细胞中获取足够RNA量相当困难。本文首次将LCM与RNA线性扩增结合用于膀胱癌相关基因研究,目的是确定一条切实可行的技术路线,将膀胱移行上皮细胞从膀胱粘膜中分离出来,将膀胱癌细胞从肿瘤间质细胞中分离出来,并对其进行RNA体外线性扩增,以备进一步研究。方法采用LCM技术分别从正常膀胱粘膜及膀胱癌组织冰冻切片中获取膀胱移行上皮细胞及膀胱癌细胞,提取RNA,并对微量RNA进行体外线性扩增。然后用RT-PCR验证扩增前、后RNA中β-actin基因表达水平。结果对照实验I证实经LCM后RNA完整性较好;经对照实验Ⅱ初步确定设定条件下LCMshooting次数与可获得RNA量间对应关系。从膀胱粘膜种捕获膀胱移行上皮细胞25万shootings;从膀胱癌组织中获取癌细胞20万shootings。产物RNA扩增后获得片段大小为0.5-2.5kh的aRNA,且β-actin基因表达表达完整。结论LCM结合RNA体外线性扩增技术能成功地获取较为单一的研究目的细胞,扩增后RNA完整性较好,能用于进一步研究中。     

NGF与雌激素对离体培养的人头皮毛囊影响的实验研究

目的　观察神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)、雌激素 (17β E2 )与米诺地尔对离体培养人头皮毛囊生长的影响。方法　建立离体人头皮毛囊培养模型 ,加入NGF、17β E2 和米诺地尔 ,通过目镜测微器测量毛囊长度 ,利用3H TdR掺入检测毛囊 2 4hDNA合成率。结果　NGF(10 0ng ml)与米诺地尔 (12 5 μg ml)对离体培养的人头皮毛囊的生长有促进作用 (P <0 0 5 ) ;而 17β E2 (0 5μg ml)则显示有抑制作用 (P <0 0 5 ) ;NGF与雌激素组毛囊的生长长度与阴性对照比则无明显变化(P >0 0 5 ) ;3H TdR掺入检测与长度检测结果完全一致。结论　NGF(10 0ng ml)与米诺地尔 (12 5 μg ml)对离体培养的人头皮毛囊的生长有促进作用 ,而 17β E2 (0 5ng ml)则显示有抑制作用 ,NGF(10 0μg ml)可干预 17β E2 (0 5 μg ml)抑制毛囊生长的影响。     

p42MAPK siRNA诱导HeLa细胞凋亡的相关基因表达研究

目的 应用小干扰RNA(siRNA)沉默HeLa细胞MAPK p42,研究其诱导细胞凋亡的分子机制.方法 将筛选的MAPK p42靶向小干扰RNA(p42MAPK siRNA)用脂质体转染至HeLa细胞.激光共聚焦显微镜观察小干扰RNA处理的细胞内钙变化,免疫组织化学法检测细胞Bcl-2和Bax的表达,流式细胞仪检测细胞内Caspase-3的活性.结果 小干扰RNA-I和小干扰RNA-2均可诱导HeLa细胞内钙升高,导致Bcl-2表达下调和Bax表达上调,但是Caspase-3未参与细胞凋亡过程.结论 MAPK p42小干扰RNA介导的HeLa细胞凋亡与Bcl-2/Bax通路有关.     

孕酮对正常生育男性精子头部胞浆内游离钙离子浓度（[Ca^2＋]i）的影响

目的：定量分析生育男性获能后单个精子的[Ca^2 ]i基础水平以及10μM孕酮刺激后的[Ca^2 ]i动态改变。方法：生育健康男子10例，手淫法留取精液。精液液化后，应用上游技术分离活动良好的精子，之后将精子悬液置于3‘70C培养2h使之获能。获能后精子移人Petri培养皿，每皿加入终浓度为8．85μmoL／L的钙荧光探针Fluo-3／AM，370C避光孵育40min。     

先天性长QT综合征相关HERG基因A561V突变体及其真核表达载体的构建及表达

目的在收集的一个先天性长QT综合征（congenital long QT syndrome，LQTS）家系中发现HERG基因A561V突变，探讨HERG基因A561V突变体及其真核表达载体的构建方法，并观察其在真核细胞中的表达。方法采用克隆载体快速PCR法构建HERG基因A561V突变体PGEM-HERG-A561V，并应用限制性内切酶法将突变体构建到真核表达载体pcDNA3中，用Superfect转染试剂将野生型pcDNA3-HERG及pcDNA3-HERG-A561V突变体与荧光真核表达载体pRK5-GFP共转染至HEK293细胞，用细胞免疫荧光化学法检测蛋白质表达。结果构建的突变体经DNA直接测序示HERG基因cDNA1682位点碱基C变为T，构建的突变体在HEK293细胞中成功表达，其蛋白质位于细胞浆中及细胞膜上，而野生型基因的蛋白质位于细胞膜上。结论用克隆载体快速PCR法构建并表达了HERG基因A561V突变，为突变基因的进一步功能研究奠定了基础。     

游离毛囊体外培养模型构建及形态学检查的实验研究

目的：构建游离毛囊体外培养模型，观察离体培养人头皮毛囊形态变化。方法：在Williams E无血清培养基中，建立离体人头皮毛囊培养模型；通过倒置显微镜观察毛囊的形态变化；目镜测微器测量毛囊长度；3H-TdR掺入检测毛囊DNA合成率；组织学检测用冰冻切片光镜观察和电镜切片透射电镜观察。结果：毛囊有不同程度的生长，随时间后移形态结构由清晰逐渐变为模糊；冰冻切片HE染色后在光学显微镜下可清楚分辨出毛囊的结构；培养3天毛囊的内外根鞘中可见凋亡细胞，内皮根鞘较外皮根鞘明显多见。结论：在离体培养人头皮毛囊时，Williams E无血清培养基是合适的选择，该模型也是筛选促进或抑制毛发生长药物的良好模型；离体培养毛囊组织学检测用冰冻切片可以简化步骤；透射电镜可以用来观察离体培养的毛囊的形态和超微结构的变化，也可以用来协助观察细胞凋亡的状况。目镜测微器测量毛囊长度简单可行，辅以3H—TdR掺入则更为客观。     

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的：摸索一条可行的技术路线，运用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞，用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法：采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞，提取微量RNA，并对微量RNA进行纯化及浓缩，用RT—PCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果：分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000 Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCM Shooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中β-actin基因表达完整。结论：通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞，此过程不会造成细胞RNA明显降解，可以应用于下游的实验研究。     

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩,用RTPCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCMShooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中βactin基因表达完整。结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。     

激光捕获显微切割结合RNA线性扩增技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用

目的 当对有问质细胞混杂的膀胱移行上皮细胞与癌细胞进行基因差异表达分析时，激光捕获显微切割技术(LCM)是不可缺少的。LCM与RNA线性扩增结合，目的是确定一条可行的技术路线，获取均质的、足量的RNA，以备进一步用于膀胱癌相关基因研究。方法 采用LCM技术分别从正常膀胱黏膜及膀胱癌组织冰冻切片中获取膀胱移行上皮细胞及癌细胞，提取RNA，并对120ng上皮细胞RNA进行线性扩增，获得aRNA 20μg。用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)验证扩增前、后RNA中β-actin基因表达水平。结果对照实验Ⅰ证实LCM后RNA完整性较好；产物RNA扩增后获得片段大小为0．5～2．5kb的水NA，且β-actin表达完整。结论 LCM结合RNA线性扩增技术获取均一的、足量的、完整性好的目的细胞RNA．能用干讲一步研究．