人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

【摘要】 目的：探讨人髓核细胞（NPCs）诱导对人尿源性干细胞（USCs）向髓核样细胞分化的作用。方法：手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术（Western blot,WB）对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖（ACAN）、SOX-9（SRY-related high mobility groupbox gene 9）、Ⅱ型胶原（COL2）及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的mRNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组 COL2A1及ACAN荧光表达。结果：培养的USCs成骨、成脂、成软骨三系分化实验结果均为阳性;USCs中干细胞阳性标志物CD29、CD44、CD73和CD90呈高表达,未检出干细胞阴性标志物CD34和CD45。培养14d后倒置显微镜下对照组及NPCs组细胞形态无变化,实验组USCs向髓核样细胞分化,形态变化明显。经共培养诱导14d后实验组及NPCs组中的ACAN、SOX-9、COL2A1及HIF-1α基因mRNA及蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）,ACAN及COL2A1荧光强度明显高于对照组;实验组上述各种mRNA及蛋白表达与NPCs组比较均无统计学差异（P＞0.05）,实验组荧光强度与NPCs组比较无明显差异。结论：在体外实验中,人NPCs可通过共培养的方式诱导人USCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘组织工程研究提供NPCs来源。     

人尿源干细胞外泌体对退变髓核细胞生物学功能的影响

目的:探讨人尿源干细胞外泌体(USC-Exos)对退变髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响。方法 :从健康成人尿液中获得人尿源干细胞(USCs)并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对所提取细胞进行鉴定。使用USCs完全培养基培养USCs 48h后采用差速离心法从培养基中提取外泌体,应用电子显微镜、粒径分析及WB技术对USC-Exos进行形态、直径及表面标志物检测。从腰椎间盘突出症患者术中摘除的髓核中提取NPCs,并培养至P6。以加入50μg/ml USC-Exos干预的P6NPCs为实验组,以50μg/ml未培养过细胞的USCs完全培养基离心沉淀物干预的P6 NPCs为对照组,分别在干预后1～6d使用CCK-8法检测NPCs增殖情况。使用PKH26荧光染料标记USC-Exos,并用标记后的USCExos干预P6 NPCs,12h后在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况。两组在干预后48h进行β-半乳糖苷酶衰老染色检测NPCs衰老比例,免疫荧光染色观察蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达。干预后3d、5d、7d时用RT-PCR和WB检测两组NPCs中ACAN、COL2、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、多肿瘤抑制基因P16(P16)的mRNA及对应蛋白的表达量,对两组ACAN、COL2、TIMP1、P16基因的相对表达量进行比较,P0.05为有统计学差异。结果:从人尿中提取的细胞具有干细胞特性,传代培养后可从中提取粒径为50～100nm的椭圆形囊泡结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白,符合Exos特性。P6 NPCs经USC-Exos干预后细胞增殖速度变快。经PKH26标记的USC-Exos可被NPCs摄取。干预后48h实验组衰老细胞比例[(13.8±1.4)%]低于对照组[(19.6±2.4)%],ACAN、COL2的荧光强度高于对照组。干预后3d、5d、7d时,实验组细胞中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性升高(P0.05),P16基因mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性降低(P0.05),而同组内不同时间点比较无显著性差异。结论:USC-Exos在体外条件下可促进退变NPCs的增殖,提高退变NPCs中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的表达,降低P16 mRNA及对应蛋白的表达。     

干细胞外泌体治疗椎间盘退变的研究进展

外泌体是拥有由脂质构成双层球状膜的囊泡,能够被干细胞在内的多种细胞所分泌。外泌体所具有的独特生物学特性和无法替代的强大功能在细胞间通讯中发挥着举足轻重的作用。干细胞外泌体所含有的多种细胞因子、信号蛋白、脂质以及调节性核酸等成分能够对肾脏、肝脏、心脏、血管以及神经等的损伤发挥保护作用。干细胞外泌体在通过抑制髓核细胞凋亡、...     

单侧双通道脊柱内镜技术椎管减压术治疗双节段腰椎管狭窄症的早期临床疗效

目的 分析单侧双通道脊柱内镜技术(unilateral biportal endoscopy,UBE)椎管减压术治疗双节段腰椎管狭窄症(lumbar spinal stenosis,LSS)的早期临床疗效。方法 回顾性分析2020年9月—2021年12月采用UBE椎管减压术治疗的98例双节段LSS患者临床资料。男53例，女45例；年龄32～79岁，平均59.9岁。其中混合型椎管狭窄56例，中央椎管型23例，神经根管型19例。病程1.5～10年，平均5.4年。手术节段：L_2、3、L_3、42例，L_3、4、L_4、5 29例，L_4、5和L₅、S₁ 67例。患者均有不同程度腰痛，单侧下肢症状76例、双侧下肢症状22例。双节段均行双侧减压者29例，均行单侧减压者63例，分别行单、双侧减压者6例。记录患者手术时间、术中出血量、切口总长度、住院时间、术后下地时间及相关并发症。采用疼痛视觉模拟评分(VAS)评估术前、术后3 d、术后3个月及末次随访时的...     

经单孔分体内镜下单侧减压与双侧减压治疗单侧症状腰椎管狭窄症的临床疗效对比

【摘要】 目的：探讨应用单孔分体内镜（one-hole split endoscope，OSE）技术行单侧减压或双侧减压治疗中老年单侧症状中重度腰椎管狭窄症（lumbar spinal stenosis，LSS）患者的早期临床疗效。方法：回顾性分析我科自2021年1月～2021年12月应用OSE技术行单侧减压与双侧减压治疗的中重度腰椎管狭窄症的中老年患者，根据纳入及排除标准，共120例患者纳入本研究，单、双侧减压组（A、B组）分别为60例。统计并比较两组患者住院时间、手术时间、切口长度，术中出血量、手术前后腰椎动力X线片的手术节段活动度（range of motion，ROM）及矢状位平移量（sagittal translation，ST）、入路侧关节面保留率及手术节段椎管横截面积（cross-sectional area of the canal，CAC）。术前及术后7d、3个月、18个月时采用疼痛视觉模拟评分（visual analogue score，VAS）评估腰痛和腿痛程度，采用改良Oswestry功能障碍指数（Oswestry disability index，ODI）评估功能改善情况，末次随访采用改良Macnab评估临床疗效，分析并比较两组手术前后临床疗效评估结果。结果：所有患者均顺利完成手术，A组与B组住院时间比较差异无统计学意义（P>0.05），但B组的手术时间、切口长度及术中出血量均大于A组，差异有统计学意义（P<0.05）。两组术后各时间点的腰痛及腿痛VAS评分、ODI均较术前明显降低（P<0.05），组内术后各指标随时间推移改善显著，两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）；两组间术前比较差异无统计学意义（P>0.05），术后7d、3个月、18个月B组腰痛及腿痛VAS评分和ODI均较A组改善更明显（P<0.05）。两组手术节段ST、ROM手术前后比较差异均无统计学意义（P>0.05）。术后关节面保留率B组较A组更高（P＜0.05）。手术节段CAC术前两组间比较差异无统计学意义（P>0.05），但术后B组较A组更大（P<0.05），CAC改善率B组较A组更高（P<0.05）；两组术后CAC较术前均明显增大，差异有统计学意义（P<0.05），术后18个月的优良率A组为86.7%，B组为91.7%，两组间优良例数比较差异无统计学意义（P>0.05）。A组1例术后出现健侧下肢麻木不适症状，B组发生1例轻度硬脊膜撕裂。结论：OSE技术行单侧减压和双侧减压治疗中老年单侧症状的中重度中央管及双侧侧隐窝狭窄LSS安全有效，早期临床疗效确切，其中双侧减压较单侧减压更充分，临床疗效更优，但远期疗效需进一步随访。