脂肪干细胞来源外泌体促进糖尿病小鼠创面愈合的实验研究

目的探讨脂肪干细胞来源外泌体(adipose-derived stem cell released exosomes,ADSC-Exos)对糖尿病小鼠创面愈合的影响。方法取患者自愿捐赠脂肪组织,采用酶消化法分离培养ADSCs,并于第3代细胞上清液提取Exos(ADSC-Exos);透射电镜观察ADSC-Exos形态,Western blot检测膜表面标志性蛋白Alix、CD63,纳米颗粒跟踪分析仪检测粒径分布。取患者自愿捐赠皮肤组织,采用酶消化法分离培养成纤维细胞。将PKH26标记的ADSC-Exos与第5代成纤维细胞培养,共聚焦荧光显微镜观察其能否进入细胞,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)及划痕法观察ADSC-Exos对成纤维细胞增殖及迁移的影响。取24只8周龄Balb/c雄性小鼠制备糖尿病模型后,背部制备直径8 mm全层皮肤缺损创面,实验组(n=12)及对照组(n=12)创面真皮层分别注射0.2 mL ADSC-Exos及PBS。第1、4、7、11、16、21天大体观察创面愈合情况,计算创面愈合率;第7、14、21天取材,行组织学(HE及Masson)及CD31免疫组织化学染色,观察创面结构、胶原纤维及新生血管情况。结果ADSC-Exos为边缘清晰、大小分布均匀的膜性囊泡;粒径为40~200 nm,平均102.1 nm;膜表面标志性蛋白Alix、CD63均呈阳性。ADSC-Exos与成纤维细胞复合培养观察示,ADSC-Exos可进入成纤维细胞胞内,并能促进成纤维细胞增殖及迁移。动物实验显示,实验组小鼠背部创面愈合明显快于对照组,各时间点创面愈合率差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,实验组创面结构愈合更好,愈合前期新生微血管更多,愈合后期胶原纤维沉积更多;其中,第7、14、21天创面缺损长度,第7、14天微血管数量,第14、21天胶原纤维沉积百分比,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ADSC-Exos通过促进创面血管新生以及成纤维细胞增殖、迁移和胶原合成来促进糖尿病小鼠创面愈合。     

脱细胞脂肪组织制备：能否成为异体注射或原位成脂的软组织填充物

文题释义： 细胞外基质(extracellular matrix,ECM)：是由动物细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子,主要是一些多糖和蛋白,或蛋白聚糖。这些物质构成复杂的网架结构,支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。细胞外基质是动物组织的一部分,不属于任何细胞,它决定结缔组织的特性,对于一些动物组织的细胞具有重要作用。 脱细胞脂肪组织：脂肪组织移植已成为整形外科及修复重建领域重要的手段,广泛用于软组织缺损的修复和以美容为目的的软组织填充。来源于脂肪组织由细胞外基质组成的脱细胞基质已成为脂肪医学一个新的发展方向,展示出良好的应用前景。脂肪组织脱细胞基质的产生原因可以分为物理性、化学性、酶学以及多种方法的联合,不同的方法对脂肪组织清除细胞的效果不同,对细胞外基质的影响也不同,最终会使宿主对移植的脱细胞材料产生的反应不同,进而影响脱细胞产品的安全性和有效性。 背景：通过脱细胞脂肪组织构建无种子细胞的组织工程脂肪为当前软组织填充的研究热点。 目的：探讨近年来脱细胞脂肪组织的制备方法对其移植后诱导脂肪再生效果的影响,并展望其临床应用前景。 方法：检索1971年1月至2018年12月 PubMed数据、Elsevier数据库相关文献,英文检索词为“adipose tissue engineering;adipose tissue extracellular matrix;soft tissue repair;angiogenesis;adipogenic induction”。阅读近年国内外与脱细胞脂肪组织制备和移植相关的文献,从脱细胞脂肪组织制备方法的改良,交联细胞因子和生物材料等方面进行总结归纳。 结果与结论：当前研究表明,脂肪组织细胞外基质可作为软组织填充的理想支架材料,植入皮下可募集宿主干细胞并诱导期增殖和成脂分化。但现有的脱细胞方案会导致细胞外基质蛋白和结构的损失,这极大的影响了脱细胞脂肪组织植入体内的脂肪再生能力,但通过超临界二氧化碳设备脱油、机械力预处理、交联细胞因子或生物材料等手段可以减少脱细胞脂肪组织制备过程中细胞外基质蛋白的损失和或补充具有促进组织再生功能的蛋白,最终提高脱细胞脂肪组织移植后的血管和脂肪新生能力。脱细胞脂肪组织由于其天然的成脂诱导能力,在脂肪组织工程中具有强大的应用前景,若能克服其制备流程中细胞外基质蛋白损耗或在安全可控的前提下,有望成为可异体注射并原位成脂的理想软组织填充物。 ORCID: 0000-0002-9784-2874(聂佳莹) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

人脂肪源细胞外囊泡联合脱细胞脂肪组织支架构建组织工程脂肪

目的探讨人脂肪源细胞外囊泡(human adipose tissue derived extracellular vesicle,hAT-EV)联合脱细胞脂肪组织支架(decellularized adipose tissues,DAT)构建组织工程脂肪的可能性,为临床上软组织缺损修复提供新方案。方法将吸脂手术患者自愿捐赠的脂肪组织分为2份,1份脂肪组织进行脱细胞处理,并采用组织学(HE、Masson染色)、扫描电镜观察,Ⅰ、Ⅳ型胶原及层粘连蛋白免疫组织化学染色和Western blot检测进行表征。另1份脂肪组织使用去外泌体的完全培养基孵化48 h,离心收集培养基上清并使用超高速离心法获取hATEV。使用透射电镜观察其形态,纳米颗粒跟踪分析仪NanoSight分析hAT-EV粒径分布范围,Western blot检测分析hAT-EV膜表面蛋白。将PKH26荧光标记的hAT-EV与脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)共培养后,共聚焦荧光显微镜观察hAT-EV能否进入ADSCs;将hAT-EV与ADSCs共培养15 d,油红O染色评估其成脂效果。将DAT组织剪碎并注射至8只6周龄雌性C57小鼠背部两侧,左侧每周注射0.2 mL hAT-EV作为实验组,右侧每周注射0.2 mL PBS作为对照组。12周后处死小鼠,取两侧DAT新生物进行湿重称量,并通过HE染色和围脂滴蛋白免疫荧光染色评估hAT-EV在体内诱导脂肪新生的能力。结果脂肪组织经脱细胞后,HE、Masson染色示DAT主要由排列松散的胶原构成,未见细胞核;扫描电镜示DAT中未发现细胞和细胞碎片,同时可见到粗大的胶原纤维束;免疫组织化学染色及Western blot检测示,DAT中保留了Ⅰ、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白。经鉴定,hAT-EV呈双层包膜的球形,高表达CD63、凋亡诱导因子6相互作用蛋白抗体、肿瘤易感基因101,97.9%粒径分布范围为32.67~220.20 nm,峰值为91.28 nm。共聚焦荧光显微镜和油红O染色示,hAT-EV被ADSCs摄取并诱导其成脂分化。大鼠体内实验显示,实验组新生脂肪组织湿重显著高于对照组(t=2.278,P=0.048);HE染色示,实验组脂滴结构较对照组多,对照组胶原含量高于实验组;围脂滴蛋白免疫荧光染色示,实验组DAT新生物中脂肪组织比例高于对照组(t=4.648,P=0.017)。结论DAT搭载hAT-EV可作为一种诱导脂肪组织新生的新方法,在软组织缺损修复中具有潜在应用前景。