RNA干扰技术及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用

RNA干扰(RNA i)是指生物体内由双链RNA(dsRNA)介导同源序列mRNA的特异性降解,从而导致基因沉默的现象。近年来,随着对RNA i研究的不断深入,其作用机制正逐步阐明;同时作为阻断基因表达的新手段,RNA i技术也日趋完善和成熟。它具有高效性和特异性,为RNA i在肿瘤的基因治疗方面的应用提供了有力的工具。本文综述RNA i技术的有关研究进展及其在前列腺癌基因治疗研究中的应用。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

靶向KDR siRNA与5-氟尿嘧啶对PC3细胞增殖的协同抑制

目的研究以KDR为靶标的小干扰RNA(siRNA)与化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用抑制PC3细胞增殖的作用。方法已构建了Psilencer3.1-KDR siRNA表达载体,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,MTT法检测细胞生长速度的变化和流式细胞仪检测细胞周期的变化,以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1-NC的PC3细胞为对照,MTT法检测细胞在含5-FU[(0～1.56×106)nmol/L]的培养液中48h后的生存率,并计算IC50。结果转染pSilencer3.1-KDR后PC3细胞生长速度明显变慢,PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2、M期的细胞减少,与其余组相比具有统计学差异(P<0.01)。MTT结果显示,pSilencer3.1-KDR细胞组5-FU的IC50,为(898.34±44.34)nmol/L(P<0.01)。结论 KDRsiRNA与5-FU联用,可显著增强对PC3细胞增殖的抑制,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。     

乌司他丁对胃癌细胞生物学功能的影响

目的探讨乌司他丁与胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡、侵袭的关系以及可能的作用机制。方法采用不同浓度的乌司他丁(400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml)作用于体外培养的MKN-45细胞中,分为对照组、400 U/ml组、800 U/ml组、1 600 U/ml组;MTT实验检测乌司他丁对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化,采用免疫印迹法(Western blotting)检测核因子κB(NF-κB)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平。结果与对照组相比,乌司他丁显著抑制细胞的增殖(P0.05),促进其凋亡(P0.05),降低细胞的侵袭能力(P0.05)。800 U/ml组与400 U/ml组比较,差异有统计学意义(P0.05),但与1 600 U/ml组比较,差异无统计学意义(P0.05)。乌司他丁显著抑制NF-κB、Bcl-2蛋白水平(P0.05),显著增加Bax蛋白水平(P0.05);且随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强(P0.05)。结论乌司他丁可以抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,降低细胞的侵袭能力,其作用机制与NF-κB信号通路相关。     

Actinotignum schaalii血流感染1例及病原体鉴定报告

 Actinotignum schaalii是一种新型致病菌，可导致尿路感染和侵袭性感染。2022年贵黔国际总医院收治1例急性尿潴留患者血培养标本，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术鉴定结果为Actinotignum schaalii，为兼性厌氧的革兰阳性球杆菌。该病例为国内首次血培养检出Actinotignum schaalii，该患者使用头孢他啶5 d后，感染症状明显减轻，感染指标恢复正常，患者未诉发热等不适，遂出院。结合国内外相关文献，探讨Actinotignum schaalii的临床特征、鉴定及治疗。     

人苍白杆菌败血症1例分析

对人苍白杆菌败血症1例分析如下。1病历摘要患儿,1岁,因反复发热、哭闹、拒食7d入院,病程中无咳嗽、气喘、无呼吸困难、呕吐、腹泻、皮疹等症状,体温达39.3℃;7d前患儿因发热、流涕,在当地给予利巴韦林、阿奇霉素等治疗,效差,后入我院治疗     

速率法测定酶活性线性范围的分析与设定

酶法测定都有线性范围规定,如果标本酶活性过高,超过线性范围,则需要对标本稀释重做,然后乘以稀释倍数。我们在实践操作中发现,有些标本虽然超过线性范围,但反应进程曲线显示仪器仍能对其准确测定,而不需要对标本进行稀释重做。Olympus AU640大型生化分析仪就具有对异常标本自动重做功能,如对酶活性超出线性范围的标本     

RNAi介导的survivin基因沉默对PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响

目的:研究survivin基因表达沉默后对PC-3细胞的裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面产生的影响.方法:使用RNA干涉技术,用构建的pSilencer 3.1-SVV1、pSilencer 3.1-SVV2、 pSilencer 3.1-SVV3 siRNA表达质粒和阴性对照质粒pSilencer 3.1-NC转染PC-3 细胞,使PC-3 细胞的survivin 基因表达沉默,随后将细胞接种于裸鼠皮下,观察转染了各质粒的PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面的变化.结果:pSilencer 3.1-SVV2和pSilencer 3.1-SVV3质粒转染组的裸鼠肿瘤成瘤率明显下降,裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组(P＜0.01).实验终止时,肿瘤平均体积与瘤重与未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组相比减少50%-55%.结论:RNAi 介导的survivin 基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力及瘤体生长速度.