人类胚胎生殖细胞体外分化为心肌细胞的研究

胚胎生殖（EG）细胞是来源于胚胎原始生殖细胞（PGCs）的多潜能干细胞。采用无饲养层细胞、无细胞因子等的基础培养液（DMEM＋20％NBS＋0．1mM 2Me）培养EG细胞，部分在基础培养液添加10μmol／LRA＋0．75％DMSO或10μmol／L 5-氮胞苷（5-AZA）诱导人类EG细胞向心肌细胞分化，以检测其是否具有向心肌细胞自发分化的能力。9例（8．49％，9／106）胎儿EG细胞在体外分化得到20个节律性心脏跳动样细胞团，其搏动节律为20～120次／min，体外维持节律性搏动最短2d，最长至15d，呈PAS，Myoglobin，α-actin阳性；对K^＋、Ca^＋、肾上腺素等具有与在体心脏相似的反应性；透射电镜观察具有心肌细胞样结构。添加DMSO和RA或5-AZA诱导未得到跳动样心肌细胞，但可提高心肌α-actin免疫组织化学染色阳性率；表明人类胚胎生殖细胞具有向心肌细胞分化的潜能。     

人类α-actin 启动子真核表达载体的构建

目的 利用PCR技术克隆了人类α-actin 基因的启动子(约450 bp).方法 将PCR产物连接到pMD-18T载体上,酶切鉴定后测序,并进行软件分析.结果与结论 序列分析表明,扩增片段虽然与GenBank里登陆的序列同源性仅为72%,但包含有完整的启动子元件和转录专一调节因子相应的识别序列.用去掉启动子的pEGFP-N1作为框架结构,尝试构建真核表达载体,并获得了含人类心肌α-actin启动子的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P.     

胎猪胰腺干细胞扩增及诱导

目的 寻找胰腺干细胞扩增方法,为研究糖尿病的细胞治疗提供种子细胞.方法无菌采集胎猪胰腺,经胰酶消化,以含10%血清的RPMI1640培养基培养.细胞长满皿底85%时,用胰酶消化传代,传代5～6次后细胞活力下降,细胞大量死亡漂浮,留下少数贴壁的小圆细胞.将培养基中的血清浓度提高到15%,贴壁的小圆细胞能快速增殖并形成细胞克隆,4～6d便可融汇成单层.采用免疫组织化学方法对所获得的的细胞进行胰腺干细胞特征检测.结果经上述方法处理的细胞具有旺盛的增殖能力,可以连续传代,目前已传至64代.采用免疫组织化学检测细胞表达胰腺干细胞特征性标志物,胰肠同源域因子1(PDX-1)、葡萄糖转运子2(GLUT-2)、巢蛋白、波形蛋白;经诱导后细胞表达胰腺内分泌细胞的标志为胰高血糖素、胰岛素、生长抑索、胰多肽.结论通过该方法可以获得大规模扩增的胰腺干细胞,该细胞在体外诱导可分化形成胰腺内分泌部4种主要细胞.     

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5'侧序列通用表达载体的构建

目的: 检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动BglⅡ效果及构建真核表达载体pcDNA3.1-65.方法: 采用SalⅠ和BamHⅠ对pMD-T/65双酶切,得到6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列;将启动子片段插入到XhoⅠ和BglⅡ双酶切后的pGL3-Basic载体里;获得重组报告基因载体pGL3-B65.瞬时转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞,检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动效果.将β-酪蛋白基因5′侧序列插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的XhoⅠ和BamHⅠ位点之间,从而获得载体pcDNA3.1-65.结果: 长度为6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列能有效地启动荧光素酶报告基因,并正确构建了真核表达载体pcDNA3.1-65.结论: 克隆的β-酪蛋白基因5′侧序列在转录水平上具有生物学功能,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了坚实的基础.     

胚胎干细胞与生殖细胞

目的:探讨生殖细胞的发生和细胞标记及胚胎干细胞向生殖细胞分化的进展及其关系。资料来源:检索Medline1950-01/2005-12相关胚胎干细胞和生殖细胞的文献,检索词“embryonicstemcells,germcells”,并限定文献语言种类为English。同时检索CNKI1990-01/2005-12相关胚胎干细胞与生殖细胞方面的文献,检索词为“胚胎干细胞,生殖细胞”,并限定语言种类为中文。资料选择:对资料初审,选取包括胚胎干细胞和生殖细胞方面的文献,开始查找文献。纳入标准:①胚胎干细胞。②生殖细胞。排除标准:综述、重复研究类文章。资料提炼:共收集到714篇关于胚胎干细胞和生殖细胞的文献,纳入23篇符合标准的文献。资料综合:胚胎干细胞是来源于着床前胚胎的一类未分化的全能性(多能性)干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有功能细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞及原始生殖细胞来源的胚胎生殖细胞具有一定的相似形。人类、小鼠和其它哺乳动物类胚胎干细胞的分离、建系和定向分化已经取得重要进展。而且胚胎干细胞可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。原始生殖细胞、胚胎干细胞和胚胎生殖细胞具有一些共同特性,可能共同来源于早期生殖细胞。结论:胚胎干细胞在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的所有类型细胞。胚胎干细胞与各级生殖细胞有一定的相似形。     

小鼠Nanog基因的克隆及对人宫颈癌上皮细胞的作用

目的:克隆小鼠Nanog基因并构建带绿色荧光蛋白的真核表达载体pG-Nanog,观察其对人宫颈癌上皮细胞(Hela细胞)中的表达,旨在为进一步观察其对成体细胞的表型变化及细胞增殖奠定前期实验学基础。方法:实验于2006-03/09在西北农林科技大学陕西省干细胞研究中心完成。Nanog基因的克隆参照庄淑珍的方法。Nanog基因真核表达载体的构建参照GeneBank中的小鼠Nanog基因序列,以pNA992为模板扩增Nanog基因,PCR产物以BglⅡ和SacⅡ双酶切,同时将pEGFP-C1用BglⅡ和SacⅡ鉴定,将该质粒命名为pG-Nanog。Hela细胞用含10%新生牛血清的Dulbecco’s改良培养基(Dulbecco’sModifiedEagleMedium,DMEM)培养,转染Hela细胞。转染前1d,在6孔板的每个孔中接种1.2×105个细胞,待细胞生长至60%～70%汇合时,取pG-Nanog与空载体各4μg分别加入500μL无血清无抗生素的DMEM培养液中,同时将6μL稀释于500μL无血清无抗生素的DMEM(干粉)培养液中,将两者混合,室温静置20min,将复合物加入到细胞中,置37℃,体积分数0.05的CO2培养箱中转染24h后吸出复合物加入完全培养基,48h后观察荧光。合成内源对照β-actin,收集转染4d后的细胞提取RNA,反转录为cDNA,然后分别扩增Nanog基因和β-actin基因。采用RT-PCR的方法检测Hela细胞中Nanog基因的表达。结果:①pEGFP-C1载体经双酶切后获得约1kbp的Nanog基因真核表达载体片段,同预期结果相一致,测序结果同GeneBank中的序列同源性达到99.7%。②将转染48h后的Hela细胞置于荧光显微镜下观察,可见明显的荧光,转染pG-Nanog的细胞绿色荧光蛋白集中于细胞核,将转染4d后Hela细胞的总RNA进行RT-PCR检测,产物经琼脂糖电泳分析,只有转染pG-Nanog的细胞中才能够检测到Nanog基因的相应条带。③转染48h后,对细胞进行抗增殖细胞核抗原免疫组化染色,未转染细胞和转染空质粒细胞及转染pG-Nanog细胞染色结果均呈阳性,转染了pG-Nanog的Hela细胞与正常细胞和转染空载体的细胞相比细胞形态发生了一定的改变,细胞表面形成了许多突起。结论:小鼠Nanog基因的克隆、真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达均获得成功,并观察到Hela细胞发生了形态的改变。     

角膜缘干细胞培养体系的研究进展

正常角膜上皮形态稳定和功能的维持是依靠角膜缘干细胞的不断增殖和移行来实现。近年来，角膜缘干细胞的重要作用逐渐被人们所认识。本文从角膜缘干细胞的定位、体外取材、分离培养、培养条件的选择、常用体外培养的载体、鉴别方法等对角膜缘干细胞培养体系进行综述。     

LIF和IGF-1对牛胚胎干细胞分离的影响

本文研究比较了添加LIF、IGF - 1和LIF +IGF - 1对牛ES细胞分离的影响。结果表明 :①添加 1 0ng/mlLIF能提高胚胎贴壁率 ,促进ICM和ES细胞和增殖并抑制其分化 ;②添加 1 0ng/mlIGF - 1既能提高胚胎贴壁率 ,又能使ICM明显增殖的时间和传代后集落出现的时间提前 ;③添加 1 0ng/mlLIF + 1 0ng/mlIGF - 1 ,可以同时发挥两种生长因子的作用效果 ,更有利用牛胚胎干细胞的分离。因此 ,我们认为 ,在牛ES细胞的分离过程中 ,添加适量LIF和IGF - 1是非常有益的     

培养方式对自原始生殖细胞分离克隆小鼠胚胎干细胞的影响

目的比较与同源胎鼠生殖嵴共培养及其传统饲养层培养的方式,从小鼠原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞的差异。方法荻取8～14d龄的胎鼠,制备同源胎鼠成纤维细胞饲养层,采用常规饲养层培养的方式和与生殖嵴共同培养的方式,分离克隆小鼠胚胎干细胞。结果在初期分离克隆的过程中,采用共同培养的方式优于传统饲养层培养模式。结论可以采用共同培养的方式来获取小鼠初期胚胎干细胞。     

人胚胎干细胞饲养层培养体系的建立

目的建立人胚胎干细胞饲养层培养体系。方法以胎鼠和人胎儿为材料,以DMEM加15％FBS加0．1mM2ME为基础培养液,分别制备胎鼠和胎儿成纤维细胞饲养层。结果分别获得了传16代的胎鼠成纤维细胞和传7代的人胎儿成纤维细胞,建立了人胚胎干细胞饲养层的培养体系。结论胎鼠成纤维细胞和人胎儿成纤维细胞相比较,后者生长速度慢,且较易老化;胎鼠成纤维细胞饲养层更有利于人胚胎干细胞的生长;8～14d龄胎鼠最适宜制备人胚胎干细胞饲养层;在宣温条件下,以0．2％胰酶加0．04％EDTA为消化液处理原代胎鼠组织块时间以15～20min为宜。