大鼠Uqcrfs1重组质粒的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的:构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码Uqcrfs1的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定及测序正确后以磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK 293T细胞,使用RT-PCR、Western Blot方法检测重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果:测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfs1的cDNA序列正确;磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因转录与蛋白表达水平,结果达到预期。结论:成功构建大鼠Uqcrfs1的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达。     

糖尿病肾病模型中UCH-L1蛋白表达变化的研究

目的研究泛素羧基末端水解酶L1(UCH-L1)蛋白在糖尿病肾病(DN)模型中的表达变化。方法原代培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予30mmol/L葡萄糖(高糖组)、5.4mmol/L葡萄糖(正常对照组),在0、8、16、72h采用MTT法动态观察两组细胞增殖情况,Western boltting检测UCH-L1蛋白表达情况。采用自发性2型DN模型OLETF大鼠,每4周一次动态监测血糖及24h尿蛋白定量,于36周时处死大鼠,观察肾组织病理改变并采用Western boltting分析肾皮质中UCH-L1的表达。结果高糖环境能抑制大鼠肾小球系膜细胞的增殖。与正常对照组相比,高糖组系膜细胞UCH-L1蛋白表达在8、72h时点明显降低,16h时点明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。与对照LETO大鼠相比,OLETF大鼠血糖、24h尿蛋白定量均逐渐增高,36周时肾脏发生了DN的早期病理改变,且肾皮质中UCH-L1蛋白表达降低(P<0.01)。结论 UCH-L1蛋白表达在DN模型中以降低为主。蛋白降解途径失调可能在DN的发生、发展起到一定作用。     

糖尿病肾病模型大鼠中存在蛋白降解途径失调

目的 研究蛋白酶体和自噬两条主要蛋白质降解途径在细胞体外及糖尿病肾病（DN）模型大鼠体内中的变化。 方法 原代培养SD大鼠肾小球系膜细胞,观察该细胞在高糖环境中的增殖情况。分别给予30 mmol/L葡萄糖（HG组）、5.4 mmol/L葡萄糖（NC组）孵育0 h、8 h、16 h、72 h,并用Western印迹法检测蛋白酶体途径蛋白酶体α各亚基（PSMAs）和自噬途径LC3蛋白的表达。以自发性2型DN模型OLETF大鼠和正常对照LETO大鼠作体内实验,每4周动态监测血糖、24 h尿蛋白量,于36周龄处死大鼠,取肾组织,观察病理形态学并进行半定量评分;利用Western印迹法分析肾皮质中PSMAs和LC3蛋白的表达。 结果 与NC组相比,高糖环境下8 h蛋白酶体α各亚基、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达均降低,差异均有统计学意义（P < 0.05）。其他各时间点两组间差异无统计学意义。与正常对照LETO大鼠相比,OLETF大鼠血糖水平和24 h尿蛋白量逐渐升高,差异有统计学意义（P < 0.01）。OLETF大鼠肾小球硬化指数和肾小管间质纤维化指数均显著高于LETO大鼠,差异有统计学意义（P < 0.01）;OLETF大鼠36周龄肾皮质中PSMAs蛋白表达明显减少,与正常对照LETO大鼠差异有统计学意义（P < 0.05）,LC3Ⅱ蛋白表达也有降低趋势,但差异无统计学意义。 结论 蛋白降解途径失调可能在DN的发生、发展中起了一定的作用。     

柴黄益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠肝损伤保护作用的实验研究

目的:探讨柴黄益肾颗粒对实验性糖尿病肾病大鼠肝损伤的保护作用。方法:健康雄性Wistar大鼠112只,顺应性喂养3d后,随机分为假手术对照组12只,单侧肾切除组100只,造模成功后随机分为:模型组、柴黄益肾大、中、小剂量组、蒙诺组。观察柴黄益肾颗粒对大鼠肝重指数、血糖、血脂、24小时尿蛋白定量、肝组织糖原蓄积程度、肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原及肝组织病理的影响。结果:与模型组比较,柴黄益肾颗粒能够显著减低大鼠肝重指数(P0.05),降低血清总胆固醇、甘油三酯以及尿液中24h尿蛋白定量(P0.05);与蒙诺组比较,柴黄益肾颗粒能够显著减轻大鼠肝组织糖原蓄积程度、炎症活动度,同时柴黄益肾颗粒抑制了Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝组织中的表达。结论:柴黄益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠肝损伤具良好的保护作用。     

L-FABP在肾脏疾病中的研究进展

肝型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acid binding protein,L-FABP,FABP1）属于脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein,FABP）家族的成员之一,是一组低分子量（14～15kD左右）的可以结合长链脂肪酸的高保守性胞质蛋白。     

大鼠ETFβ基因过表达对NADPH氧化酶基因表达的影响

目的:构建大鼠ETFβ的重组质粒并检测其在人胚胎肾293T细胞中的表达和对NADPH氧化酶的影响。方法:应用RT-PCR方法从大鼠肾脏组织总RNA中扩增出编码ETFβ的cDNA,克隆至pUM-T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,酶切鉴定后测序,测序正确后用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,使用RT-PCR方法检测空载体组和重组质粒转染组的NADPH氧化酶各亚基mRNA水平的表达变化。结果:(1)测序结果证实PCR扩增得到编码ETFβ的cDNA序列正确;(2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,ETFβ融合蛋白成功表达;(3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的NADPH氧化酶5个亚基中的NOX3,NOX4的mRNA表达降低(P<0.05),空载体组和重组质粒转染组之间比较NOX1,NOX2,NOX5的mRNA表达差异无统计学意义。结论:成功构建大鼠ETFβ的重组质粒,该重组质粒可在HEK293T中过表达,并且降低了NADPH氧化酶NOX3,NOX4的mRNA表达水平。