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目的构建人肌纤生成调节因子1全长的真核表达质粒,并观察其在HEK293T细胞系及Sprague-Daw-ley乳鼠心肌细胞中的表达。方法从NCBI GenBank数据库中克隆得到人肌纤生成调节因子1基因(AF417001)全长序列,与真核表达载体质粒pcDNA3.1/Myc-His(-)B连接并转化大肠杆菌XL1-Blue,筛选阳性克隆,T7引物测序,转染细胞后以逆转录聚合酶链反应、Western Blotting方法检测人肌纤生成调节因子1的表达。结果pcDNA3.1/Myc-His(-)B-hMR-1质粒经测序证实目的基因序列正确,无碱基突变。该质粒转染到HEK293T细胞系和乳鼠心肌细胞后人肌纤生成调节因子1的转录水平及表达水平明显增高。结论成功构建了人肌纤生成调节因子1全长的真核表达载体并确定了简便有效的乳鼠心肌细胞瞬时转染方法。 相似文献
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目的通过不同浓度的叔丁基过氧化氢（Tert-Butyl bydroperoxide，TBHP）作用于培养的小鼠胚肺成纤维细胞系L929细胞，观察低浓度的TBHP对细胞生长、增殖的影响。方法按TBHP的终浓度从低到高分别为：空白组（0μmol／L）、低浓度组（1μmol／L）、中浓度组（10μmol／L）和高浓度组（40μmol／L）分成四组。通过破壁灵芝孢子粉水提液（2．0s／L）作用L929细胞系24h，使细胞同步化，分别加入相应浓度的TBHP溶液。用MTT比色法检测细胞活力，并以溴脱氧尿嘧啶核苷（bromode-oxyuridine，BrdU）的免疫荧光染色法观察各组细胞的增殖变化，同时在相差显微镜下观察细胞的形态学变化。结果镜下观察发现，TBHP1μmol／L组细胞密度高于空白组和中、高浓度组，且BrdU阳性细胞数目最多，细胞生长旺盛；MTT结果显示TBHP1μmol／L组OD值最高，其次为空白组和中浓度组，高浓度组最低（P〈0．01），BrdU阳性荧光显色主要在刚刚分裂完成的细胞，呈现“镜像性”改变。结论低浓度TBHP对体外培养L929细胞的增殖、生长具有一定促进作用，BrdU阳性荧光显色细胞的“镜像性”改变是反映细胞增殖活性的有效判定指标。 相似文献
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目的探索肌纤生成调节因子-1（myofibrillogenesis regulator-1,MR-1）通过调节肌原纤维生成引起心肌肥大的机制。方法干预MR-1在体外培养的新生乳大鼠心肌细胞中的表达,检测心肌细胞表面积、心房利钠因子和脑钠肽水平及蛋白合成速率3种心肌肥大指标的变化,以鬼笔环肽 异硫氰酸荧光素标志并观察肌节F-actin组装,以半定量反转录 聚合酶链反应、免疫印迹和细胞免疫荧光术检测重要肌节分子myomesin-1、肌球蛋白调节轻链-2（myosin light chain-2,MLC-2）含量及亚细胞定位。结果MR-1过表达引起心肌细胞肥大、肌节F-actin组装明显促进、MLC-2与myomesin-1表达上调（P<0.05）以及myomesin-1的细胞核-细胞质转位;MR-1沉默后小泛素样调节因子-1过表达引起的转位和肌节F-actin组装明显抑制。结论MR-1通过促进myomesin-1和MLC-2调节肌原纤维生成引起心肌细胞肥大。 相似文献
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目的:制备抗人肌纤生成调节因子-1(hMR-1)的多肽抗体,并对其纯度、特异性、效价及适用性进行检测和鉴定。方法:TMHMM、DNAstar等软件分析hMR-1蛋白序列,选取2段优势抗原序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联,混合后免疫家兔。抗血清经过免疫亲和层析法纯化得到多克隆抗体。用ELISA法检测效价,Western blotting和细胞免疫荧光(immunocytofluorescent,ICF)法鉴定其特异性和适用范围,并观察其在乳鼠心肌细胞中的应用情况。结果:(1)抗体效价达1∶105,Western blotting检测到与预测分子量17kD相符的条带,ICF图像背景低,阳性结构清晰。(2)乳大鼠心肌细胞实验发现荧光信号浓集于核周,过表达hMR-1后荧光强度明显高于空载对照和正常对照。结论:制备的抗hMR-1多肽抗体效价及特异性可用于Western blotting及ICF实验,可识别人源性和大鼠源性抗原表位,该工作将为进一步深入研究新基因hMR-1的功能奠定基础。 相似文献
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