应用Power Builder进行人类精子库信息系统的开发

随着辅助生殖技术的开展和人类精子库的建立，应用供精人工授精治疗男性不育尤其是无精子症的需求增多，各精子库的精源更是供不应求。面对日趋繁琐的供精者和受精者信息，人类精子库信息系统在精子库的管理中也起着越来越重要的地位。Power Builder是目前公认的最优秀的数据库前端开发工具之一，具有开发速度快、成本低、质量高、功能强等特点。本文介绍利用Power Builder 9．0软件进行人类精子库信息系统的开发。     

鹿藿根4种提取物抗雄性小鼠生育作用比较

目的:比较4种鹿藿根提取物(乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物及水溶物)的抗生育作用。方法:60只雄性昆明种小鼠分为生理盐水对照组、雷公藤多苷对照组、乙醇提取物组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组及水溶物组,每组10只。各组药物浓度均为1%,雷公藤多苷为0.1%水溶液。每次0.1ml/10g,灌胃,1次/d,连续给药,共11周。在用药10周后,一对一雌雄合笼交配1周。分笼10d后处死雌鼠,观察妊娠率、活胎数、死胎数。11周后处死雄性小鼠观察附睾精子、附睾及睾丸病理变化情况及血清睾酮含量测定。结果:连续用药11周,与生理盐水对照组相比,实验组小鼠妊娠率下降,其中水溶物组最为明显(P<0.05)。雷公藤多苷对照组和水溶组精子明显减少(P<0.05)。组织学观察鹿藿根提取物对精原细胞、初级精母细胞影响不显著。各提取物组血清睾酮差异无显著性(P>0.05)。生理盐水对照组、雷公藤多苷对照组、乙酸乙酯提取物组、正丁醇提取物组、乙醇提取物组及水溶物组的抗精子发生效应积分分别0、(5.3±1.5)、(2.6±1.7)、(2.9±1.2)、(2.2±0.9)、(2.1±1.0)分。结论:4种鹿藿根提取物均有抗生育作用,但水溶物作用更强且对睾丸组织及睾丸生精能力影响较小。     

杜仲对糖尿病大鼠扑捉行为和阴茎组织神经传导通路的影响

目的:探讨杜仲改善勃起功能的药效和病理学机制。方法:雄性糖尿病(DM)大鼠30只随机分为3组:A组(10只,DM大鼠赋形剂灌胃组)、B组(10只,DM大鼠西地那非灌胃组)、C组(10只,DM大鼠杜仲灌胃组)及10只正常对照组大鼠(赋形剂灌胃,D组);灌胃4周后观察4组大鼠扑捉行为,透射电镜检查阴茎组织有髓神经纤维超微特征;用免疫组化二步法显示阴茎组织中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达。结果:与A组比较,C组大鼠扑捉次数显著增多(P<0.05),阴茎组织中nNOS表达显著增强(P<0.001)。透射电镜显示:A组大鼠阴茎组织有髓神经纤维排布失序,部分变性、板层分离形成透明空泡或网络状,C组大鼠有髓神经纤维排列规整,板层结构清晰。结论:杜仲可通过减轻有髓神经的损伤、增强阴茎组织中nNOS表达改善ED。     

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

精子微生物动静态分析技术的新进展

本文简单介绍了荧光染色精子新技术在CASA系统中的地位、意义和它的特点，以及它在操作功能上的独到之处。     

Attractin mRNA和Attractin蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达变化

目的:通过定量检测和比较Attractin(Atrn)mRNA和Atrn蛋白在小鼠睾丸发育过程中的动态变化,为进一步研究Atrn在睾丸的生理作用提供实验依据。方法:用相对定量法检测Atrn mRNA在生后1、5、10、15、21、28、35、42、56和120天龄小鼠睾丸发育过程中的表达变化,并用Western blot方法检测各天龄小鼠睾丸Atrn蛋白表达。结果:Atrn mRNA和Atrn蛋白在小鼠睾丸发育过程中的表达变化趋势相似,在生后第1天两者均有表达,但是处于相对较低水平,此后是一个逐渐增高的过程,在28天出现较明显上调。在这之后,两者表达变化出现差异。Atrn mRNA在生后28~35天表达最丰富,随后稳定于这一水平,Atrn蛋白表达则是继续增加直至成年。结论:Atrn参与精子发生的启动、精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成等过程,并有助于Leydig细胞进一步成熟。     

Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症模型大鼠附睾中的表达

目的:验证Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症模型大鼠附睾中的表达,探讨Binl—b在病理状态下附睾中表达的改变。方法:取雄性大鼠30只,随机分为两组,模型组给予雷公藤(10mg/ kg/d)灌胃,连用8W成少弱精子症模型;对照组给予1%羧甲基纤维钠混悬液灌胃。采用免疫组化S—P法和原位杂交方法检测Binl—b蛋白和Binl—bmRNA在两组大鼠附睾组织中的表达情况。结果:Binl—b蛋白表达于对照组、模型组大鼠的附睾管腔上皮、主细胞、基细胞,但在模型组中表达明显增强(P<0.01)。Binl—bmRNA表达于模型组、对照组附睾管腔上皮、主细胞、基细胞,但其在模型组中的表达明显增强(P<0.01)。结论:Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症大鼠附睾内表达较正常大鼠明显增强,提示Binl—b可能是病理状态下雄性大鼠生殖系统的内源性防御分子之一。     

大鼠睾丸支持细胞的分离、纯化和鉴定

目的 培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞,并应用检测ABP mRNA原位杂交方法加以鉴定.方法 选用18～22d龄SD雄性大鼠睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.1%透明质酸酶、 0.1%胶原酶三酶依次消化法分离支持细胞,置于32℃ 5% CO2的培养箱培养,48h后用20mmol/L Tris-HCl低渗处理培养细胞.培养1周后应用伊红染色、吖啶橙荧光染色、Feulgen染色对所培养的支持细胞进行鉴定,同时应用原位杂交检测ABP mRNA方法鉴定分离培养的支持细胞.结果 培养1周后所获培养的支持细胞纯度达95%以上.分离培养的支持细胞ABP mRNA表达阳性,其形态结构特征与用其他方法鉴定为支持细胞的形态结构特征一致.结论 采用三酶连续消化及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,而且应用原位杂交方法检测ABP mRNA是一种新的、特异、有效的鉴定支持细胞及其功能的方法.     

Expression of Attractin in male reproductive tract of human and mice and its correlation with male reproduction

The expression of Attractin mRNA and protein in testis and semen of human and male mice was investigated. Human testis and semen samples were all collected from Reproductive Center of Reumin Hospital, Wuhan University in December, 2012. Testis samples were collected from 7 cases of obstructive azoospermias when they were subjected to diagnosed testis biopsy, and 30 nor- mal human semen samples were obtained from those cases of semen analysis. Adult mice testis tis- sues were obtained from 10 2-month-old male BALB/c mice, and 60 male mice at different ages were classified into 10 groups （day 1, 5, 10, 15, 21, 28, 35, 42, 56, and 120 respectively, n=6 each）. The expression of Attractin mRNA and protein in testis was detected by RT-PCR and Western blotting re- spectively. Human semen samples were centrifuged into sperm plasma （SP） and sperm extract （SE）, and mice sperm samples were collected from the epididymis of 10 adult male BALB/c mice. Western blotting was used to determine the Attractin protein expression level. Attractin mRNA and protein were expressed in the testis of both patients with obstructive azoospermias and adult Bcl/B mice. Quantitative RT-PCR revealed that no Attractin mRNA was detectable in day 1 male BALB/c mice group. The Attractin mRNA and protein levels were low on the day 10, and increased with age until day 56. On the day 120, the expression levels of Attractin were decreased. As for human semen sam- pies, Attractin protein was expressed in both SP and SE, but didn＇t exist in samples from the epidi- dymis of male BALB/c mice. It was suggested that Attractin acted as a novel active substance and was involved in male reproduction in both human and BALB/c mice, but it exerted a different ex- pression profile in different mammal species.     

弱精子症动物模型中尿纤溶酶原激活因子的含量及表达情况研究

目的:利用奥硝唑所致弱精子症动物模型,采用免疫组化方法和RT-PCR技术,了解尿纤溶酶原激活因子(uPA)在弱精子症动物模型中的含量及表达情况,初步探讨奥硝唑所致弱精子症动物模型的机制及uPA作为预防或治疗弱精子症药物的可能性。方法:48只雄性SD大鼠随机分为1d用药组,5d用药组,10d用药组,15d用药组,20d用药组和对照组,每组8只,用药组每天给予奥硝唑200mg/kg,对照组给予0.5%羧甲基维素钠连续灌胃,用药组分别在给药第1、5、10、15、20d后24h内,麻醉处死动物取附睾和睾丸。低渗肿胀试验检测精子细胞膜完整性,免疫组化方法动态观察睾丸与附睾组织中uPA蛋白表达情况,RT-PCR检测睾丸组织中uPAmRNA含量。结果:奥硝唑持续给药构建弱精子症时,精子膜完整性下降发生在给药的第10d,并一直维持低值。与建立弱精子症模型同步的uPA在睾丸和附睾组织蛋白表达及mRNA含量下降在用药15d,下降趋势上是平行的,而显效性稍滞后。用药15d组与用药20d组uPA蛋白表达、mRNA水平分别与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:精子细胞膜受损、运动能力下降与uPA表达及含量下降平行,奥硝唑所致弱精子症模型形成可能是由于uPA含量及表达下降所致。弱精子症形成原因较复杂,uPA含量及表达的下降可认为是弱精子症形成因素之一,检测uPA含量可能有助于弱精子症的诊断和预防。