人源化基因修饰猪红细胞与人血清免疫相容性的体外研究

目的 探讨野生型（WT）、四基因修饰（TKO/hCD55）和六基因修饰（TKO/hCD55/hCD46/hTBM）猪红细胞与人血清的免疫相容性和免疫差异。方法 收集20名不同血型志愿者的血液,将WT、TKO/hCD55和TKO/hCD55/hCD46/hTBM猪红细胞、ABO-相容（ABO-C）及ABO-不相容（ABO-I）人红细胞分别暴露于不同血型人血清中,检测血凝集、抗原抗体结合（IgG、IgM）水平和补体依赖细胞毒性,评估2种基因修饰猪红细胞与人血清的免疫相容性。结果 ABO-C组未出现明显凝集;WT组和ABO-I组凝集水平高于TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组（均为P<0.001）。WT组猪红细胞裂解水平高于ABO-C组、TKO/hCD55组和TKO/hCD55/hCD46/hTBM组;ABO-I组猪红细胞裂解水平高于TKO/hCD55组、TKO/hCD55/hCD46/hTBM组（均为P<0.01）。TKO/hCD55组猪红细胞IgM和IgG结合水平均低于WT组和ABO-I组;TKO/hCD55/hCD46/hTBM组猪红细胞IgG和...     

痢特灵的新用途

<正> 痢特灵是临床常用的一种呋喃类抗菌素,具有较广的抗菌谱,临床常用于治疗肠炎和菌痢。近年来,痢特灵在如下方面又有     

α1,3半乳糖转移酶基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学与组织学的比较

目的探讨α1,3半乳糖转移酶(GGTA1)基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学与组织学发育变化的异同。方法选取GGTA1基因敲除巴马克隆猪2头(BM164和BM155)及核供体巴马猪1头(BMM2),利用大体解剖学和常规石蜡切片HE染色技术,对其心脏和肺脏进行解剖学与组织学比较研究。结果核供体成年健康巴马猪心脏呈倒置圆锥形,前缘凸,后缘短而直,心表面冠状沟和左右纵沟清晰可见;心壁结构完整,可分3层,心内膜较薄,心室内膜下有较多浦肯耶纤维,心肌排列紧密,横纹清晰,闰盘少且不清楚,心外膜较厚,无髓神经纤维明显。GGTA1基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪相比较,心脏在解剖学与组织学构造上均未见明显差异。核供体成年健康巴马猪肺脏呈粉红色海绵状,质软而轻,富有弹性;肺脏小支气管软骨丰富,黏膜下层内气管腺明显,可见炎性细胞,细支气管黏膜皱褶呈指状向管腔凸起,周围有炎性细胞浸润,肺泡大小较一致,肺泡壁较厚,尘细胞少见。GGTA1基因敲除巴马克隆猪肺脏解剖学与组织学结构与核供体巴马猪基本一致。结论 GGTA1基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学构造无明显差异,组织学结构正常,心、肺发育良好。     

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的 获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础.方法 利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5''调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-HindIII-EGFP.鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将HindIII酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3''端的内含子剪接受体位点(splicing acceptor site,SA)突变为HindIII内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP.三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率.结果 转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光.RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-HindIII-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高.结论 通过突变胰岛素启动子第一内含子的3''端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪.     

人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC杀伤作用初步研究

目的：探讨人血型抗体IgG、IgM对基因修饰猪外周血PBMC和RBC的结合和杀伤差异，为猪-人异种肾移植临床应用的供体猪血型选择提供理论依据。方法：抽取20例健康正常人、20例终末肾病患者和20例脑死亡器官捐献者血清，并根据ABO血型分成4组（A血型：n=20;B血型：n=17;AB血型：n=7;O血型：n=16）。用流式细胞术检测4组人血清分别与O血型野生型（WT）、α1、3-半乳糖基转移酶基因敲除（GTKO）、胞苷酸N-乙酰神经氨酸羟化酶基因敲除（GTKO/β4GalNT2KO）、β1、4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2基因敲除（GTKO/CMAHKO）和3种基因敲除（TKO/hCD55）猪外周血单个核细胞（PBMC）和红细胞（RBC）的抗体结合或补体依赖的细胞毒性试验（CDC）。结果：A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体IgM和IgG分别对WT猪PBMC,GTKO猪PBMC,GTKO/β4GalNT2KO猪PBMC,GTKO/CMAHKO猪PBMC,TKO/hCD55猪PBMC的结合和杀伤无明显差异。A血型、B血型、AB血型和O血型人血清抗体分别对WT猪RBC,GTKO猪RBC...     

异种肝移植手术前后移植肝差异表达基因的筛选及验证

目的探讨异种移植手术前后移植肝内差异表达基因的变化,并且进行筛选及验证。方法以α-1, 3-半乳糖苷转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、藏酋猴为受体,完成4例异种脾窝辅助性肝移植手术。于供肝修整时切取适量术前标本,于移植肝开放血流后48小时以肝穿刺活检获得术后标本。对手术前后的移植肝标本进行miRNAs和mRNAs的高通量芯片分析,筛选出关键的差异表达miRNAs和m RNAs,并进行实时定量PCR及Western Blot实验验证。结果与术前相比,有165个miRNAs在术后出现差异表达,其中上调分子112个,下调分子53个。筛选并验证mi-23b等12个出现显著差异表达的miRNAs,除miR-150和miR-126-3p外,其他miRNAs的表达变化情况与miRNAs芯片结果基本相符。与术前相比,有2 035个mRNAs在术后出现显著差异表达,其中922个表达上调、1 113个表达下调,筛选IGFBP6、CDK2AP1、TNFAIP6、FⅦ、NKG2D等5个生物学功能与肝脏移植密切相关的差异表达基因进行m RNA和蛋白水平验证。除NKG2D外,其他4个基因的蛋白水平表达变化与mRNA水平变化基本一致(均P <0.05),但CDK2AP1的蛋白变化幅度较小,差异无统计学差异(P=0.073)。结论异种肝移植术后移植肝的miRNAs和mRNAs表达出现较大变化,这些差异表达基因可能与免疫损伤及凝血功能障碍有关。     

流式细胞术检测供体猪α-1,3-Gal和人源CD46的表达

目的检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46(hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体。方法采集500μl野生型(wild type,WT)、α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)、hCD46和GTKO/hCD46巴马小型猪血液,分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(FITC-GSIB4)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测α-Gal抗原敲除情况,异硫氰酸荧光素标记的hCD46膜辅蛋白抗体(antiCD46-FITC)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测h CD46蛋白表达情况。结果 GTKO和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面α-Gal检测呈阴性,WT和hCD46巴马猪检测呈阳性,与测序结果一致;hCD46和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面hCD46蛋白检测呈阳性,WT和GTKO巴马猪检测呈阴性,与PCR鉴定结果一致。结论建立了微量血液流式细胞术直观检测供体猪α-Gal抗原和人源CD46蛋白表达的方法。     

GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猕猴3例报道

目的 探索GGTA1基因敲除猪胰岛细胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果.方法 本研究采用GGTA1基因敲除新生猪胰岛细胞开展了3例猪-猴异种胰岛移植实验.结果 3只猕猴成功进行胰岛细胞移植治疗,术后生命体征平稳,未发生静脉栓塞症状.移植后血糖和外源胰岛素用量均显著降低,能检测到特异性猪C肽.移植后3只猕猴均发生了酮症酸中毒症状...     

六基因编辑猪-食蟹猴异种肾移植围手术期监测初步报道

目的 探讨六基因编辑猪-非人灵长类动物异种肾移植模型的构建。方法 将人源化基因编辑猪（GTKO/β4GalNT2KO/CMAHKO/hCD55/hCD46/hTBM）的肾脏移植给食蟹猴,观察受体存活情况及恢复血流灌注后肾脏情况。定期监测肾脏实质回声、血流变化及大小;进行血常规、肾功能检测及电解质检测;监测尿液、粪便及体质量动态变化。食蟹猴生命终点取移植肾、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、盲肠行病理学检查。结果 受体术后7 d死亡。恢复血流后,肾脏灌注良好,器官质地柔软,色泽正常。受体生命终点时见肾脏腹侧有少量脓性分泌物附着,明显充血肿大,呈“大红肾”外观。术后随时间延长,肾实质回声增高,血流减少,皮质逐渐增厚,肾周及腹腔有少量积液。受体术后外周血红细胞、血红蛋白、白蛋白及血小板进行性下降,血清肌酐在术后7 d升高至308μmol/L,K+变化不大。术后即有淡黄色尿液排出,术后3 h内即恢复饮食及饮水并排淡黄色成形大便1次。术后1 d内尿液颜色逐渐变淡红至恢复正常,尿常规检测结果相符。术后2 d晨起排褐色血便2次,量较多,予以奥美拉唑进行抑酸治疗,至术后4 d大便恢复正常。β2-微球蛋白在术后7...     

hCD47诱导人巨噬细胞对猪内皮细胞的免疫耐受

目的探讨人CD47(hCD47)在诱导人巨噬细胞对猪内皮细胞免疫耐受中的作用。方法将转染了pCDH-hCD47-FLAG质粒的猪髂总动脉内皮细胞(PIEC)设为pCDH-hCD47组;将转染了pCDH-FLAG空载体质粒的PIEC为pCDH组;将转染了hCD47-dN的PIEC设为pCDH-hCD47-dN组;将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)设为阳性对照组。将细胞分别与人巨噬细胞共培养,检测信号调节蛋白α(SIRPα)的磷酸化情况以及人巨噬细胞对PIEC的杀伤作用。进一步从GT-/-及GT-/-/hCD47基因编辑猪中分离了猪主动脉血管内皮细胞(PAEC),并分析SIRPα的磷酸化情况及人巨噬细胞对PAEC的杀伤作用。结果 pCDH组细胞不能诱导SIRPα的磷酸化,而pCDH-hCD47组细胞与人巨噬细胞共培养10 min后便能够激活SIRPα的磷酸化,且随着共培养时间的延长,SIRPα的磷酸化程度也随之增强。pCDH-hCD47-dN组细胞不能激活SIRPα的磷酸化。人巨噬细胞对p CDH组细胞产生了明显的杀伤作用,p CDH-h CD47组细胞可明显抑制人巨噬细胞的杀伤作用(P0.05),而pCDH-hCD47-dN组细胞则不能抑制人巨噬细胞的杀伤作用。GT-/--PAEC与人巨噬细胞共培养后,不能激活SIRPα的磷酸化;而GT-/-/hCD47-PAEC与人巨噬细胞共培养后则明显激活了SIRPα的磷酸化。人巨噬细胞对GT-/--PAEC产生了明显的杀伤作用,GT-/-/hCD47-PAEC可明显抑制人巨噬细胞的杀伤作用(P0.05)。结论在猪内皮细胞中表达hCD47可以通过激活SIRPα的磷酸化抑制人巨噬细胞对内皮细胞的杀伤作用。