NF-κB/p65特异的RNAi腺病毒载体的构建及其对p65表达的抑制效应

目的构建NF-κB p65亚基特异的RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体，并验证其对p65亚基的基因沉默效应。方法设计合成三对针对p65 mRNA不同位点的短发夹RNA（shRNA）编码序列，克隆到穿梭载体中，通过体外同源重组将短干扰RNA（siRNA）表达盒转移到腺病毒骨架质粒，构建RNAi腺病毒表达载体；在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定；腺病毒感染人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞，Western印迹法和免疫细胞化学法验证构建的RNAi腺病毒对p65蛋白表达的抑制效应。结果成功构建了NF-κB p65亚基特异的RNAi腺病毒表达载体，获得高滴度的腺病毒液；RNAi腺病毒感染ECV304细胞后可以高效抑制p65蛋白的表达，且对p65蛋白表达的抑制作用可持续6d以上。结论应用RNAi腺病毒表达载体能有效阻断目的基因的表达。     

危重症患者血催乳素、免疫功能与预后的关系

目的 本研究探讨危重症患者血清催乳素(prolactin,PRL)水平、免疫功能改变及预后的关系.方法 选择福建省立医院内科重症监护室2010年10月1日至2011年10月1日收治的符合标准资料完整的80例危重症患者,根据预后分为死亡组与存活组.分别于入院第2天、第4天、第8天早晨抽取空腹血,用化学发光免疫分析系统检测其外周血血清PRL,流式细胞仪检测其外周血中T淋巴细胞亚群,免疫速率散射比浊法检测其外周血中体液免疫五项,并用多因素重复测量方差分析对两组进行比较分析.结果 和存活组比较,死亡组危重症患者血清PRL值(P为0.037,0.036,0.030)和外周血CD3+(P为0.034,0.023,0.023)、CD4+(P为0.046,0.003,0.046)、CD8+(P为0.040 1,0.039,0.045)细胞百分数明显低于存活组.血清PRL值和CD3+、CD4+、CD8+正相关(P为0.004,0.043,0.003),血清PRL值越高,CD3+、CD4+、CD8+细胞百分数越高.结论 细胞免疫的改变,对患者的预后有重要影响,细胞免疫下降,提示预后不良.血清PRL对细胞免疫功能可能有着正调节作用.     

2型糖尿病合并周围神经病变病人血清Cys-C水平与神经传导参数的相关性

目的:分析血清胱抑素C(Cys-C)表达水平与2型糖尿病(T2DM)合并周围神经病变(DPN)病人神经传导参数的相关性。方法:选取2021年1月—2021年11月广汉市人民医院收治的118例T2DM病人,根据DPN并发情况将其分为合并DNP组(61例)和单纯T2DM组(57例)。比较两组一般资料、血清Cys-C水平及神经传导参数,分析血清Cys-C与神经传导参数的相关性,评估Cys-C与神经传导参数对T2DM病人DPN并发情况的预测效能。结果:两组性别、年龄、体质指数(BMI)、舒张压比较差异均无统计学意义(P>0.05),合并DNP组糖尿病病程明显长于单纯T2DM组(P<0.05),收缩压明显大于单纯T2DM组(P<0.05);合并DNP组血清Cys-C水平均明显高于单纯T2DM组(P<0.05),正中神经感觉传导速度(SCV)、正中神经运动传导速度(MCV)、腓总神经SCV、腓总神经MCV均明显低于单纯T2DM组(P<0.05)。Pearson相关性分析表明,T2DM合并DNP病人血清Cys-C水平与正中神经SCV、正中神经MCV、腓总神经SCV、腓总...     

GSK-3β特异siRNA腺病毒对脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶3B(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,初步探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度.GSK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,Western印迹和免疫细胞化学法检测其对GSK-3β和β-catenin蛋白表达的影响,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖.结果 成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液.构建的重组腺病毒感染HUVEC显著抑制GSK-3β蛋白的表达,增加β-catenin的蛋白表达.重组腺病毒感染3、5、7 d后,细胞增殖率明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 构建的GSK-3β特异的siRNA腺病毒能有效抑制GSK-3β基因的表达,促进β-catenin的蛋白表达,上调Wnt/β-catenin信号通路对人脐静脉内皮细胞增殖有重要的影响.     

血管内皮细胞中NF-κB和p38MAPK的激活

高糖在血管内皮细胞中引起氧化应激将激活细胞内一系列应激激活的信号通路，包括NF-κB、p38MAPK等，主要结果是以不同基因表达产物引起内皮细胞功能紊乱，在糖尿病慢性血管并发症的病因学中起重要作用。近年来有许多研究报道了NF-κB和p38MAPK信息通路在高糖引起的内皮细胞凋亡中的作用，为防治糖尿病血管并发症提出了新的靶向治疗策略。     

用RNA干扰腺病毒载体研究Wnt/β-连环蛋白信号途径对人甲状腺细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,从转录后水平抑制GSK-3β基因表达,探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人甲状腺细胞增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建短发夹RNA(shRNA)腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度;RNAi腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞,Western印迹法检测其对GSK-3β蛋白表达的抑制效应;利用构建的RNAi腺病毒抑制GSK-3β表达,BrdU法检测原代培养人甲状腺细胞增殖活性.结果 成功构建了GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液;RNAi腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞后,GSK-3β蛋白的表达受到明显抑制,β-catenin蛋白表达显著增加(1.324±0.057 vs 0.935±0.029,P<0.05);腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞1、3、5、7 d后,RNAi腺病毒组比空病毒组细胞增殖率明显增加(1.473±0.035 vs 1.312±0.043、1.226±0.045 vs 0.959±0.066、0.776±0.041 vs 0.605±0.054、0.337±0.018 vs 0.259±0.021,P<0.05).结论 构建的目的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制GSK-3β基因的表达;Wnt/β-catenin信号通路在人甲状腺细胞的增殖中有重要影响.     

NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的 研究高糖尤其是波动性高糖对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响,以及NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡中的作用。 方法 构建针对NF-κBp65 mRNA序列1566位点的重组RNAi腺病毒表达载体,并利用RNAi腺病毒抑制HUVEC p65表达。应用流式细胞术及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）研究NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡的作用。 结果 高糖（20.5 mmol/L或30.5 mmol/L）可以促进HUVEC凋亡。NF-κBp65 特异腺病毒感染HUVEC后,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白转录,使核内p65蛋白表达处于基础水平。TUNEL结果示高糖作用后5 d,高糖组细胞凋亡率显著高于正常葡萄糖组（25.81％±1.77％比8.20％±0.63％,P < 0.05）,Ad-DEST＋高糖组（26.10％±0.98％）与单独高糖组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P > 0.05）。Ad-1566＋高糖组的细胞凋亡率（11.49％±0.92％）比Ad-DEST＋高糖组显著下降（P < 0.01）。TUNEL法及流式细胞术检测结果均显示NF-κBp65 特异腺病毒可以降低高糖诱导的HUVEC凋亡。结论 高糖可以促进HUVEC凋亡。腺病毒感染HUVEC可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核转录,从而保护高糖作用的HUVEC凋亡。     

应用RNA干扰技术研究游离脂肪酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术探讨游离脂肪酸(FFA)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的影响.方法 利用体外同源重组技术构建糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特异的siRNA腺病毒表达载体,在人胚胎肾293A细胞中包装并扩增病毒,应用空斑实验法测定病毒滴度.选用GsK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,采用Western blot方法检测其对GSK-3β和β-catenin 蛋白水平的影响.FFA贮存液按油酸盐:棕榈酸盐2:1配制,RNAi腺病毒和FFA共同干预HUVEC,采用流式细胞术、Hoechst 33258染色检测细胞凋亡.实验分为0.75 mmol/L FFA组、GSK-3β特异性RNAi腺病毒(Ad-640)+FFA组、未重组RNAi腺病毒(Ad-DEST)+FFA组、正常细胞组.采用方差分析进行数据比较.结果 构建的RNAi腺病毒感染HUVEC可以显著抑制GSK-3β蛋白的表达,上调细胞内β-catenin蛋白水平.0.75 mmol/L FFA具有促进细胞凋亡率的作用,荧光染色可见细胞出现典型的凋亡形态学改变;Ad-640+0.75 mmol/L FFA组与0.75 mmol/L FFA组(F=26.42,P<0.01)及Ad-DEST+0.75 mmol/L FFA组(F=23.34,P<0.01)相比细胞凋亡率显著减少,凋亡形态学改变亦明显减少,而Ad-DEST+FFA组与FFA组细胞凋亡率无显著差异(F=5.56,P>0.05),凋亡形态学改变相似.结论 构建的CSK-3β特异性RNAi腺病毒对FFA作用下的HUVEC具有部分保护作用.     

缺血性脑小血管病患者血清β淀粉样蛋白1-42、脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子-1水平与血管性认知功能障碍的相关性分析

目的探讨缺血性脑小血管病患者血清β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平与血管性认知功能障碍(VCI)的相关性。方法 2018年12月至2020年12月我院收治的86例缺血性脑小血管病患者,根据有无VCI分为VCI组和认知功能正常组。比较两组血清Aβ1-42、BDNF、IGF-1水平并分析三项指标与蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分的相关性。评估血清Aβ1-42、BDNF、IGF-1水平对缺血性脑小血管病患者VCI的诊断价值。结果 VCI组血清Aβ1-42、BDNF、IGF-1水平低于认知功能正常组(P<0.05)。三项指标与MoCA评分均呈负相关(P<0.05)。血清Aβ1-42、BDNF、IGF-1及联合检测的AUC分别为0.795、0.727、0.734、0.911。结论缺血性脑小血管病患者血清Aβ1-42、BDNF、IGF-1水平参与到认知功能障碍的发生发展过程,对于诊断缺血性脑小血管病患者是否出现VCI具有重要意义。