骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

人骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪源性间充质干细胞的成骨研究

目的 探讨人骨形态发生蛋白-2（hBMP-2）基因修饰的人脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）的成骨能力及基因转染对ADSCs成骨分化的生物学调控。方法 流式细胞技术鉴定从人脂肪组织中提取的细胞为间充质来源的干细胞。将ADSCs转染hBMP＋2基因，免疫沉淀＋Western blotting法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测hBMP-2表达，确定hBMP-2表达量及表达稳定性，碱性磷酸酶（ALP）染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR分析hBMP-2基因转染对ADSCs向成骨细胞转化的调控，并将转基因细胞注入裸鼠股部肌内，通过X线及组织学检查观察体内成骨情况。结果 流式细胞术证实从脂肪中提取的细胞为间充质来源的干细胞。转基因后免疫沉淀＋Western blotting法和ELISA法显示转染hBMP-2的ADSCs具有较高且稳定的hBMP-2的表达，转染21d后表达量无明显降低。ALP染色、ALP定量测定、钙结节染色及RT—PCR发现转基因ADSCs向成骨细胞方向发生分化。裸鼠肌内注射转基因细胞后2周即显示有异位骨形成，4周明显增多，对照组无骨组织形成。结论 转染hBMP-2基因的ADSCs在持续稳定高表达目的蛋白的同时，自身向成骨细胞发生分化，并在裸鼠体内形成异位骨。因此，ADSCs有望作为新的基因工程种子细胞。     

重组结核抗原痘苗病毒Ankara株的构建及其免疫原性研究

目的 构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒,并研究其特异免疫原性.方法 运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中.重组质粒导入痘苗病毒Ankara(MVA)后构建重组痘苗病毒,经筛选和Western blot鉴定,得到5个种类的带有结核抗原基因的重组病毒.用构建的5种重组病毒免疫小鼠,MTT法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞对特异结核抗原的增殖反应;ELISA检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ的含量;结核菌素纯蛋白衍化物(PPD)皮内试验以检测重组病毒引发的针对结核抗原的特异细胞免疫应答.结果 构建的5种蘑组病毒介导的细胞表达产物经Western blot鉴定确认相对分子质量与结核抗原一致.免疫小鼠两次后,5种重组病毒免疫组脾淋巴细胞体外与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养后表现出明显的增殖活性(P<0.01),培养上清液中IFN-γ的浓度均较同组细胞经生理盐水刺激明显增高(P<0.05);与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比,5种重组MVA免疫组脾淋巴细胞与AgB5A.ESAT-6融合蛋白共培养后同样表现出明显的增殖活性(P<0.01),与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养的细胞上清液中IFN-γ的浓度均升高(P<0.01).与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比,5种重组MVA免疫组小鼠对PPD都表现出显著的迟发型超敏反应应答(P<0.05).结论 成功构建了5种不同类型的表达结核杆菌抗原的重组痘苗病毒疫苗,其免疫小鼠后可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫.     

聚乙二醇修饰胰高血糖素样肽1类似物反应条件的响应面法优化#br#

目的 用响应面法对马来酰亚胺活化相对分子质量40 000的聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）（MAL-PEG_40K）修饰胰高血糖素样肽1类似物（glucagon-like peptide-1 analog,GLP-1a）的反应条件进行优化。方法 对GLP-1a浓度、GLP-1a/MAL-PEG40K摩尔比、反应液pH值、反应温度、反应时长进行单因素试验。以前3个条件为自变量, PEG修饰率为响应值,根据中心组合试验设计原理,研究各自变量及其交互作用对PEG修饰率的影响。通过高效液相色谱法分析PEG修饰率,依据回归分析确定各反应条件的最优值。 结果 GLP-1a与MAL-PEG_40K的最佳反应条件为：GLP-1a浓度2.5 mg/ml,GLP-1a/MAL-PEG_40K摩尔比1∶1.25,反应液pH 8,反应温度4 ℃,反应时长60 min。该优化条件下,GLP-1a的PEG修饰率可达91.0%。结论 响应面法获得了GLP-1a与MAL-PEG_40K的最佳反应条件。     

CTLA4Ig抑制BMP2基因转染的MSCs诱导的免疫应答

目的通过腺病毒介导人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4Ig)及人骨形态发生蛋白2(BMP2)在骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达,探讨CTLA4Ig对BMP2转染的异基因MSCs诱导的免疫应答的抑制作用。方法以CTLA4Ig和BMP2重组腺病毒转染MSCs。ELISA法检测包装的病毒感染MSCs后,CTLA4Ig及BMP2蛋白的表达;观察CTLA4Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用。结果腺病毒载体介导CTLA4Ig和BMP2体外感染的MSCs能够分泌CTLA4Ig及BMP2蛋白,且CTLA4Ig融合蛋白可以有效抑制AdBMP2基因转染的MSCs的刺激作用。结论给予CTLA4Ig腺病毒进行基因治疗可有效的抑制AdBMP2转染的异基因MSCs引起的免疫应答,诱导MSCs移植耐受;为BMP2基因修饰的同种异体间的MSCs移植提供了实验依据。     

腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因修复兔桡骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2（Adv-hBMP-2)基因对兔骨髓间充质干细胞（BMSCs)的诱导成骨活性及修复长骨干骨缺损的效果。方法 （1）抽取兔骨髓行BMSCs培养，经Adv-hBMP-2转染后分别行免疫沉淀加Western印迹法和碱性磷酸酶（ALP）检测及von Kossa染色，并行裸鼠肌内诱导成骨试验。（2）修复兔桡骨缺损：15只兔30侧、1.5cm的骨缺损分为Adv-hBMP-2转染BMSCS加珊瑚及胶原载体组、β半乳糖苷酶（Adv-βgal)转染BMSCs加载体组、未转染BMSCs加载体组、载体组和未治疗组，术后行X线、组织学检查。结果 （1）Adv-hBMP-2组BMSCs表达hBMP-2，其ALP活性升高，并有钙结节形成,裸鼠肌内注射后有异位成骨。（2）在兔桡骨缺损处，Adv-hBMP-2转染组有明显骨痂形成，5个组的愈合率分别为4／5、2／5、2／5、0／5、0／5。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs是修复骨缺损的好方法。     

SpyTag/SpyCatcher体系蛋白共价连接条件的分析

目的 比较不同实验条件下SpyTag/SpyCatcher体系共价连接的效率,分析得出优化后的连接条件,为今后相关纳米颗粒疫苗的开发提供实验依据。方法 用大肠埃希菌系统表达分别带有SpyTag和SpyCatcher结构的两种蛋白,摸索共价连接的反应时间、温度、缓冲体系和混合比例,采用非还原型凝胶电泳检测共价连接的效率。结果 反应时间对共价连接的影响有统计学意义（F=22.028,P<0.05）,带有SpyTag和SpyCatcher结构的两种蛋白质可形成稳定的共价键,6 h后连接效率约为50%,偶联蛋白在25 ℃稳定存在至少72 h。反应温度和缓冲体系对共价连接的影响没有统计学意义。SpyTag和SpyCatcher结构蛋白比例为物质的量比1.0∶2.0混合。结论 SpyTag/SpyCatcher共价连接体系的关键工艺参数为反应时间,且能适用于多种温度和缓冲条件。     

骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓间充质干细胞修复羊胫骨干骨缺损

目的 评价腺病毒介导的人骨形卷发生蛋白2(Adv-hBMP-2）基因转染的羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)对长骨干骨缺损的修复效果．方法 22只羊，体重18．1～29．5kg．制造羊胫骨干骨缺损(2．1cm)．分为4组：Ⅰ组．Adv-hBMP-2转染BMSCs组(8只)；Ⅱ组．腺病毒介导的β半乳槠苷酶(Adv-βgal)转染BMSCs组(6只)；Ⅲ组，未转染BMSCs组(6只)；Ⅳ组，未治疗组（2只)。细胞自身分泌的细胞外基质作为细胞载体。分期行X线、计量组织学检查和生物力学测定。结果 X线检查示Ⅰ组的羊胫骨干骨缺损内有明显骨痂形成；24周，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的愈合率分别为6/7、1／5、2／5及0／1，X线疗效评分显示Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组的评分比较．差异有显著性意义。组织学检查显示，与其它组相比．Ⅰ组的新生骨量最多，并有皮质骨形成。生物力学测试示Ⅰ组的力学强度最大。结论 Adv-hBMP-2基因转染的BMSCs在缺乏骨传导性支架的条件下可修复长骨干骨缺损。     

正常孕妇及妊娠高血压综合征患者的补体系统研究

本文报道正常孕妇、妊高征患者6个补体成分(C_1q、C_3、C_4、C_5、B因子和C_1-INH)血清值的变异并探讨其意义。162名正常妊娠后期妇女与40名正常育龄妇女对照,结果显示C_1q和C_3随妊娠的进展而升高;血清C_1q、C_1-INH水平低于正常妇女,而血清C_3、C_5则高于正常妇史(P均<0.01)。提示孕后期补体激活经典途径既活跃又受抑制;母体体液免疫效应降低,使胎儿不受排斥,妊娠得以正常进展方面具重要意义。230名妊高征患者与126名同孕期正常孕妇对照,结果表明C_1q随病情的加重而降低,B因子升高(P<0.01)。提示患者体内存在较强烈的免疫反应,病情与免疫反应强弱呈正相关;C_1-INH水平显著增高可能为机体自身稳定功能的反映。     

人乳头瘤病毒及其疫苗研究现状

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的持续感染是导致妇女宫颈癌的关键因素.随着对HPV及其致病机制研究的深入和免疫学的发展,新型HPV预防性疫苗已在多个国家上市,治疗性疫苗的研究也有新的进展.此文对HPV及HPV疫苗的新进展做一综述.