CD-TK双自杀基因系统联合染料木黄酮对鼠前列腺癌的治疗作用

CD-TK双自杀基因包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因,能将丙氧鸟苷(GCV)及5-氟胞嘧啶(5-Fc)等无毒的前体药物转化成毒性药物,抑制RNA及DNA合成,从而导致肿瘤细胞的凋亡,研究表明二者协同可以显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用[1].而染料木黄酮具有弱雌激素作用,能够显著抑制前列腺癌(PCa)细胞的生长[2].我们通过实验研究探讨染料木黄酮和CD-TK双自杀基因联合应用对PCa的治疗作用,现报告如下.     

胸苷激酶/更昔洛韦系统联合肿瘤坏死因子-α治疗鼠膀胱癌

目的 观察腺病毒介导胸苷激酶/更昔洛韦(TK/GCV)系统联合肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对鼠膀胱癌的杀伤作用.方法 构建MB49小鼠皮下模型,随机分为对照组、TK/GCV组、TNF-α组、联合治疗组.按治疗计划分组进行病毒及药物注射,实验结束测量肿瘤体积大小,进行组织病理学检查.结果 体外实验验证低浓度TNF-α联合GCV较单纯GCV对细胞的杀伤率明显增强,差异有统计学意义(P＜0.01).流式细胞仪检测,联合治疗组较单独用药组凋亡率明显提高,差异有统计学意义(P＜0.01).动物实验结束后肿瘤体积对比:TK/GCV组为(93.43±2.10) mm3、TNF-α组为(53.95±2.61)mm3、对照组为( 171.52±4.33) mm3、联合治疗组为(18.23±1.11) mm3,联合治疗组肿瘤体积较其他各组明显缩小,差异有统计学意义(P＜0.01).苏木素-伊红(HE)染色见各治疗组均出现细胞坏死凋亡,其中联合治疗组仅于周边见少量肿瘤细胞存活.结论 GCV对转染腺病毒MB49细胞及TNF-α对MB49细胞均有良好的抑制生长作用,且呈浓度依赖性；TK/GCV、TNF-α均能有效诱导凋亡,且两者具有协同作用；TK/GCV系统联合小剂量TNF-α能增强自杀基因系统对小鼠膀胱癌的治疗作用.     

腺病毒介导TK/GCV基因系统联合肿瘤坏死因子对膀胱癌细胞的体外杀伤作用

目的 研究腺病毒介导TK/GCV系统联合肿瘤坏死因子(TNF-?)对膀胱癌细胞的体外杀伤作用.方法 采用含有TK基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒(adv )转染MB49细胞,观测转染率,RT-PCR检测转染细胞TK基因产物.以MB49细胞为对照,测定不同浓度TNF-?作用下MB49细胞、不同浓度GCV作用下MB49/TK细胞的存活率,采用GCV联合低浓度TNF-?对MB49/TK细胞进行体外杀伤研究;流式细胞仪检测TK/GCV、TNF-?、TNF-? TK/GCV对MB49细胞作用8 h后细胞凋亡情况.结果 随着浓度的增高GCV对MB49/TK细胞、TNF-?对MB49细胞的生长抑制率逐渐增高.GCV联合TNF-?对细胞杀伤率均较同浓度下单纯GCV及单纯TNF-?作用时的细胞杀伤率有明显增强,且随TNF-?浓度增高联合治疗组杀伤效率增强:单纯50 ?g/ml GCV组、5 ?g/ml TNF-? 50 ?g/ml GCV组、20 ?g/ml TNF-? 50 ?g/ml GCV组杀伤率分别(24.39±1.10)％、(40.05_ 0.97)％、(65.47±0.67)％.流式细胞仪检测细胞周期示TK/GCV、TNF-?、TK/GCV TNF-?组作用细胞8 h均可见典型sub-G1期细胞凋亡峰,联合作用组凋亡率最高.结论 TNF-?能明显增强TK/GCV自杀基因系统对膀胱癌的杀伤作用,两者联合能够有效促进膀胱癌细胞的凋亡.     

采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源膀胱癌特异性抗体基因库

目的构建大容量且能高效展示于哺乳动物细胞表面的全长人源膀胱癌特异性抗体基因库。方法分离膀胱癌患者的外周血单核细胞（PBMC）,提取PBMC的总RNA,用RT-PCR方法扩增全套IgG1重链可变区（VH）和Kappa型轻链全长（LCκ）基因,经过相应的限制性内切酶酶切后分别插入pDGB-HC-TM载体,分别构建膀胱癌特异性的抗体重链基因库和轻链基因库（一级抗体库）。随机挑取20个单克隆测定抗体基因序列,并瞬时转染FCHO细胞,结合流式细胞仪检测细胞表面抗体的表达。将上述构建好的轻重链基因库通过4片段连接方法插入双表达载体pDGB4,构建二级抗体库,转染FCHO后用流式细胞仪检测细胞表面抗体表达。结果分别成功构建了膀胱癌特异性的重链基因库和轻链基因库,随机挑取的轻重链单克隆各有7个和9个含有正确的抗体基因编码序列,且能展示于哺乳动物细胞表面,理论库容量达到3.32×10¹¹[（1.7×10⁶×70%）×（3.1×10⁵×90%）]。成功构建了膀胱癌二级抗体库,库容量为9×10⁵。结论利用哺乳动物细胞表面展示技术,我们成功构建了膀胱癌特异性的全长人源抗体基因库,一级抗体库的库容量达到3.32×10¹¹,二级抗体库库容量达到9×10⁵,为下一步筛选特异性、高亲和力抗膀胱癌抗体奠定了基础。     

新方法简便高效建立小鼠原位膀胱癌模型

目的 用物理化学的方法建立小鼠原拉表浅膀胱癌模型,并对影响成瘤率的因素进行探讨,筛选出高效简便建立小鼠原位表浅膀胱痛模型的方法.方法 用改造过的静脉留置针经小鼠尿道插入膀胱腔内,实验组用酸碱腐蚀的方法对小鼠膀胱粘膜进行预处理,按观察目的 的不同分为4组:对照组不作预处理.PBS冲洗后将MB49灌注入膀胱,构建小鼠原位表浅膀胱癌模型.所有小鼠观察一般情况和肿瘤生长情况.按计划处死小鼠并解剖观察膀胱肿瘤生长情况及有无转移,取标本做病理切片.结果 病理显示膀胱粘膜已预处理的小鼠接种肿瘤细胞后可在膀胱部位成瘤(成瘤率100%);丝裂霉素能显著减缓膀胱肿瘤的生长(P<0=0.000,P<0.05);对照组接种肿瘤细胞后未见成瘤.结论 膀胱粘膜处理的时间以酸20 S,碱5 S较合适;简便的物理化学方法成功建立了可靠性、稳定性和重复性均好的小鼠原位表浅膀胱癌模型,为表浅膀胱癌术后复发的防治研究尤其是抗癌药物的筛选和免疫治疗研究提供了理想的动物实验模型.     

链亲和素标记的GM-CSF治疗膀胱癌疗效的初步观察

目的：将链亲和素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位锚定成瘤小鼠膀胱,探求该新疗法的口行性和有效性.方法：选择雌性C57BL/6小鼠50只,随机均分成5组,组1到组4建立原位表浅膀胱癌模型后,按照处理的不同又分为PBS组、GM-CSF组、SA-GFP组和SA-GM-CSF组,分别给予相应治疗 6次治疗后,SA-GM-CSF组和组5（对照组）接受第二次肿瘤细胞攻击 观察所有小鼠的一般情况、肿瘤情况和生存期,并对死亡小鼠进行解剖,留取器官组织做病理切片或免疫组织化学染色.结果：SA-GM-CSF组与其它各组比较,肿瘤出现的时间晚,肿瘤生长速度慢,小鼠生存期长（Pmax=0.023,P＜0.05） MB49细胞二次攻击后,SA-GM-CSF组与对照组相比,生存期差异有显著统计学意义（X2=9.551,P=0.002）.结论：SA-GM-CSF原位锚定于雌性C57BL/6成瘤小鼠膀胱黏膜,有效抑制了膀胱肿瘤的生长,延长了小鼠的生存时间,并且能抵抗同源肿瘤的再次攻击,提示可能诱导了小鼠针对MB49的免疫保护作用 SA-GM-CSF原位锚定治疗比单纯细胞因子灌注法疗效更好.     

男性因素对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

目的探讨男性因素对体外受精-胚胎移植(IVF-ET)妊娠结局的影响。方法回顾性分析首次行IVF-ET的新鲜移植周期,共2 806例,对不同妊娠结局组的男性因素进行比较,并运用Logistic回归方程分析各种男性因素对IVF-ET妊娠结局的影响。结果妊娠组的男性年龄[(32.5±4.3)岁]小于未妊娠组[(32.9±4.4)岁],活产组的男性年龄[(32.4±4.3)岁]和卵泡刺激素(FSH)[(5.3±2.5)IU/L]均小于未活产组[(33.0±4.4)岁,(5.5±2.6)IU/L],流产组的男性年龄[(33.5±4.3)岁]、FSH[(5.9±3.0)IU/L]和体质量指数(BMI)[(24.1±3.5)kg/m2]均大于未流产组[(32.4±4.3)岁,(5.3±2.5)IU/L,(23.5±3.3)kg/m2],差异有统计学意义(P0.05);经多因素回归分析,通过控制女方因素的影响后,未见所研究男性因素对IVF的妊娠结局有影响(P0.05)。结论男性因素协同女性因素共同影响IVF-ET的妊娠结局,男性高龄、高FSH、高BMI者的妊娠和活产机会可能较低,流产率可能较高。     

SA-hTNF-α膜锚定修饰治疗表浅膀胱癌的实验研究

目的 探讨一种新型蛋白质锚定技术与人肿瘤坏死因子α(hTNF-α)相结合在小鼠表浅膀胱癌治疗中的作用.方法 将120只雌性C57BL/6j小鼠分为5组:正常未处理组(空白对照组)、PBS对照组、可溶hTNF-α治疗组、SA-GFP锚定组、SA-hTNF-α锚定治疗组,每组22只小鼠.建立小鼠正位表浅膀胱癌模型,24 h后,将小鼠膀胱内膜生物素化,继而将hTNF-α融合蛋白灌注人小鼠膀胱中.每4 d重复膀胱灌注锚定治疗1次,共6次.免疫组化检测SA-hTNF-α融合蛋白在生物素化的小鼠膀胱黏膜的存留时间及膀胱黏膜和肿瘤组织中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的分布,观察肿瘤生长情况及小鼠的生存期.检测肿瘤特异性淋巴细胞的杀伤活性.用MB49细胞再次攻击对SA-hTNF-α融合蛋白治疗有效的小鼠,观察肿瘤生长情况及小鼠的存活期.结果 免疫组化显示:SA-hTNF-α融合蛋白可以在膀胱黏膜表面上稳定存留7d;MB49肿瘤细胞膀胱内种植后第60天,SA-hTNF-α锚定治疗组有18只小鼠存活(18/22),其中9只小鼠体外无触及肿瘤;PBS组全部死亡.对9只无瘤存活的小鼠再次用MB49细胞皮下攻击,60d后5只小鼠仍存活(5/9),与对照组有显著性差异(P<0.05).膀胱癌病灶中CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞,SA-hTNF-α锚定治疗组较PBS对照组明显增多(P<0.05).SA.hTNF-α锚定治疗组小鼠的杀伤效应明显强于正常组小鼠(P<0.05).结论 SA-hTNF-α稳定的原位锚定于小鼠膀胱黏膜表面,可有效抑制小鼠表浅膀胱癌进展,显著延长荷瘤小鼠的生存时间,有效抵抗同源肿瘤细胞的再次攻击.     

基于BRB—ArrayTools和GATHER工具对膀胱癌相关基因的挖掘及生物信息学分析

目的：从分子水平探讨膀胱癌的发病机制,为临床诊疗提供新思路。方法：从公共基因芯片数据库（GEO）中下载人膀胱癌的相关基因芯片数据,使用BRB-ArrayTools软件对其进行分析,筛选差异基因;并利用GATHER工具进行生物信息学分析。结果：BRB分析发现122个差异表达基因,其中上调55个,下调67个;GATHER分析发现这些差异基因的功能主要集中在细胞的生理过程、细菌凝聚反应的诱导作用、Jak～STAT和Toll—like受体的信号通路及细胞因子相互作用等生物学过程。结论：利用生物信息学方法能有效分析基因芯片数据并获取内在信息,为确定膀胱癌的早期诊断标志与治疗靶点提供新的思路。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子修饰MB49制备膀胱肿瘤疫苗及应用

目的 链亲和素标记的细胞因子锚定MB49细胞和成瘤小鼠膀胱,探讨锚定率、锚定量与时间的关系.方法 MB49细胞与链亲和素标记的绿色荧光蛋白(SA-GFP)体外锚定后,在荧光显微镜下观察;建立小鼠原位表浅膀胱癌模型后,实验组膀胱灌注锚定链亲和素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM-CSF);对照组小鼠不锚定直接膀胱灌注SA-GM-CSF.取膀胱作冰冻切片免疫组织化学分析.结果 MB49细胞基本被SA-GFP锚定,锚定率为98.78%;冰冻切片免疫组织化学显示实验组膀胱黏膜有阳性显色,以第1天最浓,以后逐日变淡,至第7天仍可见较明显染色;对照组膀胱黏膜无阳性显色.结论 链亲和素标记的细胞因子可以锚定在细胞表面,且锚定效率高、保留时间长.

Abstract：

Objective Streptavidin (SA)-tagged cytokine was anchored to MB49 cells in vitro and biotinylated mucosal surface of bladder wall in vivo. The anchoring rate was calculated and the effects of anchoring and the relation between anchoring effect and time were observed. Methods Streptavidin ( SA) tagged green fluorescent protein (SA-GFP) was anchored to MB49 cells in vitro and observed under an fluorescence microscope. Female C57BL/6 mice with superficial bladder cancer were intravesically instilled with NHS-PE04-Biotin, PBS, SA-GM-CSF as SA-GM-CSF group, and PBS, SA-GM-CSF as PBS group.All the mice were killed to obtain their snap-frozen bladders for cryosectioning, and then immunohistochemistry analysis with biotin-conjugated HRP and DAB display liquid kit. Results SA-GFP was anchored to the surface of MB49 cells under the fluorescence microscopy, and the anchoring rate was 98.78%.SA-GM-CSF was detected on the biotinylated mucosal surface of bladder wall up to 7 days after its intravesical immobilization in SA-GM-CSF group, but no SA-GM-CSF was found in PBS group. Conclusion SA-GFP can be anchored to the surface of MB49 cells, and the anchoring rate was 98. 78%.