利用不同支架材料构建人工真皮的研究

目的 探讨脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶的不同支架材料上构建人工真皮的可行性。方法 采用酶消化法分离幼儿包皮成纤维细胞，并进行传代培养；将第3代成纤维细胞种植于三种不同支架上，14天后利用HE染色、透射电镜和扫描电镜对构建的人工真皮结构进行鉴定。结果 ①酶消化法得到皮肤成纤维细胞，可在含有10％小牛血清的DMEM中传代培养；②成纤维细胞在三种不同支架上形成单层细胞，并可向胶原膜和胶原凝胶内部生长；③成纤维细胞在胶原膜和脱细胞基质内增殖不如胶原凝胶内活跃，但人工真皮收缩不明显，而胶原凝胶构建的人工真皮收缩明显。结论 利用脱细胞基质、胶原蛋白基质网架、胶原凝胶支架材料构建的人工真皮具有较好的组织结构，是一种较理想的皮肤替代物，可作为移植物进行深入研究。     

利用胶原构建皮肤组织工程支架的研究

目的利用胶原构建皮肤组织工程支架。方法用Na2S、弹性蛋白酶预处理胎牛皮得到胶原纤维；经蛋白酶M降解胶原纤维后，0．5mol／L醋酸溶液溶解得到酸溶性胶原；再用蛋白酶N处理上述酸溶性胶原，最终得到生物相容性良好的胶原溶液；将胶原溶液构建皮肤组织工程支架。通过SDS-PAGE试验，分析酸溶性胶原分子量及基本结构；用皮肤组织工程支架材料包覆大鼠创面，观察创面愈合情况，研究支架材料对大鼠创伤愈合的影响；在支架材料上种植成纤维细胞，观察细胞扩增情况，以及支架材料对细胞移植影响。结果通过特异性蛋白酶M处理得到的酸溶性胶原，显示典型的1型胶原SDS-PAGE图谱；构建的皮肤组织工程支架呈多孔海绵状，孔径为50～200μm；在支架材料上种植成纤维细胞扩增情况良好；用于修复大鼠创面，具有促进创面愈合作用。结论酸溶性胶原经蛋白酶N处理后，生物相容性良好，适合于皮肤组织工程支架的构建，并具有良好生物活性。     

人工表皮构建及其结构的研究

目的 :以角朊细胞作为种子细胞 ,构建人工表皮 ,检测培养的人工表皮的结构 ,为进一步进行动物移植试验奠定基础。方法 :(1)采用分散酶 (dispase)分离表皮细胞 ,以无血清培养法培养表皮细胞。 (2 )人工表皮构建成功后 ,分别进行HE染色及透射电镜观察。 (3)角蛋白免疫组织化学染色。结果 :经过 2～ 3周的培养 ,表皮细胞连接成片 ,呈现典型的“铺路石”状 ;继续培养 5～ 7d后 ,将细胞膜消化下来 ,HE染色显示由 2～ 4层细胞组成 ,电镜可以观察到桥粒及张力微丝束的结构 ;免疫组织化学染色显示培养细胞和细胞膜角蛋白染色阳性。结论 :该人工构建表皮与人正常表皮结构类似 ,可作为移植物进行深入研究     

以牛胶原凝胶为支架构建人工真皮的研究

目的：制备成纤维细胞胶原凝胶(即真皮替代物)，以研究细胞的生长、分化、增生及与真表皮问的相互作用，为研制大面积创面覆盖物——复合皮奠定基础。方法：①酶消化法培养胎儿成纤维细胞；②制备细胞胶原凝胶，分为Ca—gel和Cf-gel组，接种后于不同时间观察两组细胞的形态变化和胶原凝胶的收缩情况；③细胞计数；④SEM观测胶原凝胶的表面是否有成纤维细胞附着；⑤HE染色。结果：①成纤维细胞形态及增殖情况：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状，可出现较明显的细胞增殖，并可见凝胶收缩现象，但Ca-gel组较小；人工真皮质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性和抗拉性，不易脆。②细胞计数法所得两组生长曲线基本相似。Ca-gel和Cf-gel组细胞均具有典型的细胞增殖现象，Cf-gel组细胞在后期的增殖略快于Ca-gel组。③扫描显微镜下可见到凝胶表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于凝胶上。④HE染色可见胶原呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞分布于胶原凝胶内部和表面。结论：①培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物，是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础，并可与培养的人工表皮膜片混合移植，起到促进表皮细胞的生长黏附和加速创面愈合的作用。②成纤维细胞在胶原凝胶中有着活跃的生物学特性，因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为以及在皮肤组织工程学的研究中，以胶原凝胶为支架的三维培养系统较脱细胞基质系统更为科学。