人survivin蛋白的表达、纯化与单克隆抗体制备

目的:表达人survivin重组蛋白并制备单克隆抗体.方法:表达含有survivin基因的重组质粒pRSETB-survivin,表达人survivin重组蛋白,以此为抗原,常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS21细胞融合,得稳定分泌survivin mAb的杂交瘤细胞株,ELISA检测mAb的相对亲和力,Western blot检测mAb的特异性.间接免疫荧光观察骨肉瘤细胞中survivin的表达情况.结果:重组载体pRSETB-survivin转化入大肠杆菌BL21中表达所得蛋白经Western blot验证为目的蛋白.筛选出2株能稳定分泌特异性抗人survivin的mAb杂交瘤细胞株,免疫球蛋白亚类均为IgG类;单克隆抗体的亲和常数为S1 1.52×10-9mol/L,S2 2.31×10-9mol/L.Western blot结果显示,2株单抗识别相对分子质量为20 000的survivin单一条带,并发现在骨肉瘤细胞中survivin主要表达在胞浆内.结论:成功地表达出人survivin重组蛋白,制备出抗人survivin mAb,为进一步用于survivin的免疫学检测及骨肉瘤生物学治疗奠定了基础.     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的研究体外三维培养条件下,成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向分化软骨细胞可行性。方法用密度梯度离心法分离纯化BMSCs,并传代扩增后,用离心三维培养法在软骨诱导剂下进行诱导培养,以常规培养液培养的BMSCs作为阴性对照,于诱导培养第21天取出标本行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、s-100蛋白免疫组织化学检测。结果BMSCs经21d的离心三维诱导培养后,培养管出现软骨外观组织块,组织切片甲苯胺蓝染色呈明显异染,s-100蛋白免疫细胞化学检测阳性。对照组阴性。结论成人BMSCs在三维培养条件下可成功诱导分化为软骨细胞。     

反义RNA抑制Survivin在人骨肉瘤细胞系MG63中表达的实验研究

[目的]研究人骨肉瘤细胞MG63中反义RNA对Survivin表达的抑制作用。[方法]培养骨肉瘤细胞MG63，采用RT—PCR的方法克隆人Survivin基因编码区cDNA。构建Survivin的反义诱导表达载体。转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。稳定转染的细胞系，以ZnSO4 120μmol／L诱导，HE染色、Survivin免疫细胞化学染色透射电镜等形态学观察。绘制生长曲线。RT—PCR检测各组细胞Survivin的表达。Annexin V法检测细胞凋亡。[结果]RT—PCR从MG63细胞mRNA扩增了Survivin编码区cDNA，约420bp。构建了pMDNA3-anti—Survivin重组质粒。转染MG63细胞，G4181000μg/ml筛选4周后，建成稳定转染细胞系。通过ZnSO4 120μmol／L诱导，电子显微镜观察可见MG63／pMDNA3-anti—Survivin细胞出现凋亡。免疫细胞化学染色可见诱导后的MG63／pMDNA3-anti—Survivin Survivin蛋白表达明显降低。AnnexinV染色后发现pMDNA3-anti—Survivin细胞，在ZnSO4诱导48h后凋亡率达到11％，较对照组高出3倍。[结论]Survivin的反义RNA能够有效的抑制Survivin的表达，从而抑制肿瘤生长，并促进肿瘤细胞凋亡．