N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基基因重组腺病毒镇痛疫苗的构建

目的 构建携带N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)基因的重组腺病毒镇痛疫苗.方法 以携带NR2B基因的腺病毒穿梭质粒pDC515-NR2B和腺病毒骨架质粒pBHGfrt(del)E1,3FLP共转染腺病毒包装细胞293细胞,连续观察细胞的形态学.取形成病毒空斑的293细胞,分别采用PCR、RT-PCR及Western blotting的方法从基因水平、转录水平和蛋白水平对病毒空斑筛选和鉴定,对鉴定正确的病毒空斑进行扩增和纯化.结果 转染后12 d可观察到细胞病变效应,15 d后形成病毒空斑.NR2B基因不仅正确插入重组腺病毒载体,而且可在293细胞正确表达NR2B蛋白.鉴定正确的病毒空斑命名为NR2B基因重组腺病毒5型镇痛疫苗,滴度为5×1011 VP/ml,纯度100%.结论 成功地构建了NR2B基因重组腺病毒镇痛疫苗,可用于疫苗镇痛的研究.     

N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位DNA疫苗免疫大鼠的效应

目的 采用N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基抗原表位(eNg2B)插人质粒载体pDC515中制备的DNA疫苗(pDC515/eNR2B)免疫大鼠,评价其免疫效应.方法 成年雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,随机分为4组:对照组(C组)、PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组,每组10只.PBS组、pDC515组和pDC515/eNR2B组分别肌肉注射PBS 100 μl、pDC515 100 μg和pDC515/eNR2B 100 μg进行免疫,1周后以等剂量再次免疫.于第1次免疫前、第2次免疫后8、14、21 d时,截尾法采集尾静脉血,分离血清,ELISA法检测NR2B抗体水平.于第2次免疫后21 d时处死大鼠取脊髓,分别采用免疫组织化学法和Western blot法检测NB2B抗体与自身腰段脊髓组织NR2B特异性结合情况.结果 第2次免疫后8 d,pDC515/eNR2B组血清中可检测到NR2B抗体,14 d时达高峰,并高滴度持续至21 d(P＜0.05);C组、PBS组和pDC515组均未检测到相应NR2B抗体;免疫组织化学法和Western blot法检测到pDC515/eNR2B组血清NR2B抗体可与自身脊髓组织NR2B结合.结论 pDC515/eNR2B可诱导SD大鼠产生体液免疫反应,所产生的自身抗体在血液中可高滴度存在一定时间.     

幽门螺杆菌感染与血清胆红素的相关性研究

背景:幽门螺杆菌(Hp)感染与冠心病、糖尿病等多种胃肠外疾病密切相关,但机制尚未明了。低血清胆红素水平是冠心病、糖尿病等的危险因素,可能参与Hp感染致病的过程。目的:探讨Hp感染与血清胆红素的相关性。方法:纳入2016年6月—2017年6月华中科技大学同济医学院附属同济医院的10 843名体检人群,评估Hp感染情况,并比较不同性别、年龄和BMI之间Hp感染率差异。比较Hp阳性组和Hp阴性组血清总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、间接胆红素(IBil)水平差异,探讨Hp感染与血清胆红素的关系。结果:Hp感染率为35. 0%,不同性别之间Hp感染率无明显差异,而不同年龄、BMI之间Hp感染率相比差异有统计学意义(P 0. 001)。与Hp阴性组相比,Hp阳性组TBil、DBil和IBil水平明显降低(P 0. 001)。多元线性回归分析显示Hp感染与血清TBil、DBil和IBil之间均呈负相关(回归系数为-0. 805,95%CI:-1. 256～-0. 353,P 0. 001;回归系数为-0. 134,95%CI:-0. 243～-0. 026,P=0. 015;回归系数为-0. 667,95%CI:-1. 047～-0. 287,P=0. 001)。结论:Hp感染与血清TBil、DBil和IBil之间均呈负相关,可能通过降低血清TBil、DBil和IBil水平而参与冠心病、糖尿病等多种胃肠外疾病的发生。     

miR-29和ZO-1在大鼠血神经屏障中的作用研究

目的:观察重组组织型纤溶酶原激活剂(rt PA)通过miR-29对大鼠外周神经闭锁小带蛋白-1(ZO-1表达水平的影响。方法:健康雌性SD大鼠随机分为对照组(Control)、rt PA组(rt PA)和无催化活性rt PAi组(rt PAi)。3组大鼠分别在坐骨神经旁注射生理盐水、rt PA和rt PAi,2 h后利用real time RT-PCR、Western Blot及免疫荧光方法检测坐骨神经内ZO-1的mRNA和蛋白表达水平变化,并采用real time RT-PCR方法检测坐骨神经miR-29的表达水平。结果:与对照组相比,rt PA组大鼠坐骨神经周围注射rt PA后,ZO-1的mRNA表达下降(P 0. 05),Western Blot发现ZO-1蛋白表达水平下降(P 0. 05),免疫荧光检测同样发现ZO-1表达减少;无催化活性的rt PAi处理大鼠坐骨神经后,神经束膜内ZO-1的mRNA及蛋白水平同样明显下降(P 0. 05);与对照组相比,rt PA和rt PAi处理2 h后大鼠坐骨神经内miR-29表达均明显增高(P 0. 05)。结论:rt PA通过减少神经束膜中ZO-1表达水平,增加神经束膜通透性,其作用不依赖于其对凝血酶原复合物的催化功能,可能通过增加miR-29表达下调ZO-1蛋白表达水平。     

右美托咪定对高迁移率族蛋白1诱导人脐静脉内皮细胞炎性反应的影响

摘要:目的 研究右美托咪定对脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)分泌高迁移率族蛋白1(HMGB1) 的影响,及其调控 HMGB1诱导 HUVECs炎性反应的分子机制。方法 100ng/mL的 LPS刺激 HUVECs16h后,用 不同浓度的右美托咪定(0.01、0.1、1、10nmol/L)分别处理细胞 4h,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞上清液中 HMGB1的含量。MTT检测不同浓度右美托咪定对 HUVECs细胞活力的影响,细胞免疫荧光检测 HMGB1的表达及 分布。将 HUVECs随机分为对照组、右美托咪定组、HMGB1组、右美托咪定+ HMGB1组,右美托咪定和 HMGB1的 浓度分别是1nmol/L、1μg/mL。ELISA 检测细胞上清液中 TNF-α和IL-1β含量,Westernblotting检测 MAPK 信号通 路的磷酸化水平,再采用 ERK1/2、p38MAPK 通路抑制剂进行阻断实验。结果 不同浓度的右美托咪定对 HUVECs 活力无影响。LPS作用后,HUVECs上清液中 HMGB1的含量增加(P<0.01),而右美托咪定可呈剂量依赖性地抑制 HMGB1的表 达 (P<0.05);LPS 刺 激 HMGB1 蛋 白 从 细 胞 核 转 移 至 胞 质,而 右 美 托 咪 定 可 显 著 抑 制 LPS 引 起 的 HMGB1移位(P<0.05)。相对于对照组,HMGB1组上清液中炎症因子 TNF-α和IL-1β含量增加(均 P<0.01),外源 性 HMGB1促进 ERK1/2、p38MAPK 和JNK 磷酸化(均P<0.05),而右美托咪定+HMGB1组可抑制上述炎症因子的 分泌并部分逆转 ERK1/2、p38MAPK 的磷酸化(均P<0.05)。p38MAPK 抑制剂(SB203580)可下调 HMGB1组IL-1β 的表达,ERK1/2阻滞剂(PD98059)可下调 TNF-α和IL-1β的表达,且与右美托咪定具有协同抑制 TNF-α和IL-1β表达 的作用(均P<0.05)。结论 右美托咪定可抑制LPS引起的 HMGB1分泌,并通过抑制 HMGB1相关的 MAPK 信号通 路发挥抗炎效应。     

血管活性药物及中药麝香对内毒素性休克的影响及其在抗休克治疗中的作用

目的 :观察缩、扩血管西药及中药麝香对低排高阻型内毒素性休克的影响 ,评价其在抗休克治疗中的疗效。方法 :大鼠随机分为对照组 (A组 )、山莨菪碱组 (B组 )、去甲肾上腺素组 (C组 )、麝香组 (D组 )。颈外静脉推注脂多糖 (LPS)复制内毒素休克模型 ,实验组分别给予山莨菪碱、去甲肾上腺素、麝香药物后观察肠系膜微循环、血压变化。结果 :推注LPS后对照组及实验组动物均发生内毒素性休克 ,出现微循环障碍。山莨菪碱能提高休克后血流速度 ,但A、C、D组微循环未出现明显改善。结论 :山莨菪碱可改善内毒素性休克的微循环瘀滞状态 ,而去甲肾上腺素 ,麝香没有明显作用。     

低氧/复氧后星形胶质细胞对永生化神经前体细胞增殖与分化的影响

目的 探讨低氧/复氧后星形胶质细胞对永生化神经前体细胞增殖与分化的影响.方法 24 h内新生SD大鼠,断头处死,分离、培养和传代星形胶质细胞,取本室构建的永生化神经前体细胞,根据培养条件的不同分为3组,每组24孔,对照组永生化神经前体细胞在正常培养条件下培养(O2 17%-CO2 5%-N2 78%);共培养组取第三代星形胶质细胞孵育24 h后接种永生化神经前体细胞,培养条件同对照组;低氧/复氧后共培养组取第三代星形胶质细胞,先置入低氧培养箱(O2 2%-CO25%-N2 93%)中孵育12 h后,恢复正常培养条件12 h,再接种永生化神经前体细胞.3组以相同密度接种永生化神经前体细胞(1×104/cm2),隔天半量置换培养基,培养时间为6 d.共培养6 d后每组取6孔,采用免疫荧光细胞化学法,观察共培养后永生化神经前体细胞的增殖与分化情况,计算其增殖倍数、神经元阳性率和星形胶质细胞阳性率.结果 与对照组和共培养组相比,低氧/复氧后共培养组永生化神经前体细胞增殖倍数升高(P＜0.05),神经元阳性率和星形胶质细胞阳性率差异无统计学意义(P＞0.05).结论 低氧/复氧后星形胶质细胞可促进永生化神经前体细胞增殖,但对其分化无影响.     

鞘内注射PKCγ抑制剂GF109203X对骨癌痛大鼠痛觉过敏的影响

目的:观察鞘内注射PKCγ抑制剂GF109203X对骨痛痛大鼠痛觉过敏的影响,探讨PKCγ在骨癌痛发病机制中的作用.方法:选取成年雌性Wistar大鼠30只(每组6只),随机分为5组,对照组(Naive组):随机选取6只正常大鼠且不做任何手术;骨癌痛(CIBP组):构建CIBP模型后,鞘内不注入任何药物;CIBP+生理盐水组(NS组):鞘内注入生理盐水10uL;CIBP+二甲基亚砜(DMSO)组(DMSO组):鞘内注入DMSO 10uL;CIBP+GF109203X(GF109203X组):鞘内注入PKCγ抑制剂GF109203X 10uL.观察各组大鼠注药前及鞘内注药后15,30,45,60,75 min时的疼痛行为学变化,且各组大鼠分别在疼痛观察结束时灌注取材,冰冻切片后检测脊髓背角PKCT的表达.结果:GF109203X组大鼠鞘内注射GF109203X后其各时点机械缩爪阈值较CIBP组明显升高(P<0.05),在注药后60 min时其机械缩爪阈与正常组相接近,差异无统计学意义(P>0.05).DMSO组大鼠在注射DM-SO后其机械缩爪阈值也逐渐升高,在注药后45,60,75 min时其阈值与CIBP组相比显著升高(P<0.05),但与GF109203X组相比,其升高后的各时点缩爪阈值仍分别小于GF109203X组相同时点缩爪阈值,且差异有统计学意义(P<0.05).经鞘内给药的NS组、DMSO组、GF109203X组,其大鼠脊髓背角PKCγ的表达量仍与CIBP组相接近,差异无统计学意义(P>0.05).结论:CIBP促使PKCγ表达增高且PKCγ参与了CIBP的发生和/或持续.     

μ受体介导靶向毁损脑干下行易化神经元对骨癌痛大鼠的镇痛效应

目的 探讨μ受体介导靶向毁损脑干下行易化神经元对骨癌痛大鼠的镇痛效应.方法 成年雌性Wistar大鼠48只,体重180～200 g,随机分为6组,对照组(n=3):不给予任何处理;骨癌痛组(n=9):于右下肢胫骨中部骨髓腔内注射Walker 256乳腺癌细胞10 μl制备骨癌痛模型;PBS组(n=9):乳腺细胞接种前28 d时延髓头端腹内侧(RVM)区单次微注射PBS;皮啡肽组(n=9):乳腺癌细胞接种前28 d时RVM区单次微注射皮啡肽;皂角素组(n=9):乳腺癌细胞接种前28 d时RVM区单次微注射皂角素;皮啡肽-皂角素耦联体组(n=9):乳腺癌细胞接种前28 d时RVM区单次微注射皮啡肽-皂角素耦联体.于乳腺癌细胞接种前1 d、乳腺癌细胞接种后3、5、7、9、11、14、16、18、20 d时测定机械痛阈.C组于乳腺癌细胞接种后20 d时,其余各组于乳腺癌细胞接种后7、14和20 d时,各处死3只大鼠,测定脊髓背角Fos蛋白表达水平.结果 与对照组比较,骨癌痛组、皮啡肽组和皂角素组接种侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后7～20 d时降低,接种对侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后9～20 d时降低,接种侧和接种对侧脊髓背角Fos蛋白表达上调,皮啡肽-皂角素组接种侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后7～14 d时降低,接种对侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后9～14 d时降低,皮啡肽组-皂角素组乳腺癌细胞接种后7 d时接种侧和接种对侧脊髓背角Fos蛋白表达上调(P<0.05);与骨癌痛组比较,皮啡肽组和皂角素组接种侧和接种对侧各时点机械痛阈和脊髓背角Fos蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),皮啡肽-皂角素组接种侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后11～20 d时升高,接种对侧机械痛阈乳腺癌细胞接种后4～20 d时升高,乳腺癌细胞接种后14、20 d时接种侧和接种对侧脊髓背角Fos蛋白表达下调(p<0.05).结论 μ受体介导靶向毁损脑干下行易化神经元可有效降低骨癌痛大鼠痛觉超敏的程度.