用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

大鼠肺鳞癌发生发展过程中肿瘤血管生成及血液供应研究

目的　探讨肺癌发生发展过程中肿瘤血管生成和血液供应 ,以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体Flk 1与肿瘤血管生成的关系。方法　 10 0只Wistar大鼠左肺下叶支气管灌注致癌质碘油 ,分批处死获取肺鳞癌癌变及进展期病变标本 ,使用油画颜料染成黄、绿两种颜色的液态硅橡胶分别灌注支气管动脉与肺动脉 ,免疫组化检测病变组织中VEGF、Flk 1的表达及vWF染色切片上的微血管密度 (MVD)。结果　经支气管动脉灌注黄色液态硅橡胶显示 ,肿瘤病灶呈黄色的新生血管团与曲张的支气管动脉相连通 ,镜下见癌巢间质肿瘤微血管腔充盈硅橡胶颗粒 ;经肺动脉灌注绿色液态硅橡胶 ,肿瘤区绿色的血管呈不连续的枯树枝、断枝、残枝状 ,与肿瘤血管不连续 ,镜下肿瘤微血管腔无硅橡胶颗粒。原位癌的MVD计数 ( 3 9.5 0± 12 .60 )与不典型增生 ( 8.92± 3 .80 )及侵袭癌 ( 61.0 5± 19.92 )比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 1)。从支气管粘膜上皮增生→鳞状化生→不典型增生→原位癌→侵袭癌 ,VEGF和Flk 1阳性系数逐渐升高。MVD与VEGF和Flk 1表达均呈正相关 (r分别为 0 .9798和 0 .90 78,P <0 .0 0 5 )。结论　肺癌新生血管形成是大鼠肺鳞癌发生发展的重要现象 ,新生的肿瘤血管与支气管动脉相连通 ,与肺动脉不相连通 ,证明肺鳞癌发生     

紧急避孕效果评价的可信性研究

目的:探索以月经周期和末次月经推算受孕期与生化诊断间出现差异的原因,进而评价紧急避孕效果判断的可信性。方法:对100例要求紧急避孕服务的妇女末次月经日期、月经周期和未保护性生活时间的确信程度进行回忆问卷调查,同时以B超作为月经周期、排卵监测手段进行对比性研究。结果:51例(52.04%)妇女确信知道末次月经的日期;9例(9.18%)妇女不能准确回忆无保护性生活时间;58.16%的妇女在该研究周期中有过1次以上的性生活;32例(32.65%)妇女B超证实与她们的周期不符合;2例妊娠,其中1例根据wilcox方法评估其妊娠危险概率为0%。结论:对于一部分妇女依赖于对末次月经、性生活时间的回忆和排卵日的推算来评价紧急避孕效果的方法显然是不准确的,应采用更合理的评价方法。     

甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子

目的:建立检测精浆游离DNA(cfsDNA)启动子甲基化水平的甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR(MeDIP-qPCR)方法。方法:提取精液参数正常(6例)和输精管结扎(6例)男性的cfsDNA,将两组不同个体的cfsDNA分别进行混合,超声处理后形成DNA片段,通过MeDIP分离甲基化DNA片段,然后用qPCR方法检测启动子甲基化水平。结果:精液参数正常组的PRAME、PEG10、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4、DAZ1和CLPB启动子甲基化水平分别为14.93%、2.64%、0.69%、2.66%、17.50%、21.10%、5.98%、2.28%、13.50%和3.86%,明显低于输精管结扎组的121.25%、73.62%、16.25%、42.90%、76.74%、112.40%、59.79%、25.85%、91.90%和64.53%。其中,PRAME、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4和DAZ1等8个启动子MeDIP-qPCR的检测结果与启动子甲基化芯片结果一致。结论:通过MeDIP-qPCR方法可以定量检测到cfsDNA中的特异性启动子甲基化,为确定cfsDNA中睾丸和附睾特异性甲基化启动子提供了有效途径。     

大鼠肺癌癌变过程中Rb肿瘤抑制途径失控的意义

目的 :探讨大鼠肺癌癌变过程中Rb肿瘤抑制途径的主要成员p16、CyclinD1和CDK4基因的动态表达和肺癌发生发展及侵袭转移的关系。方法 :用 3 甲基胆蒽 (3 methylcholanthrene,MCA)及二乙基亚硝胺 (diethylnitrosa mine,DEN)碘油溶液在 80只大鼠诱发大鼠肺癌 ,12只作为对照组。应用免疫组织化学及原位杂交技术检测大鼠肺癌癌变各阶段组织的p16、CyclinD1和CDK4基因的改变。结果 :随大鼠肺癌的发生发展 ,p16基因呈不同程度的缺失或低表达 ,其中p16蛋白在 6 0 .75 % (6 5 10 7)的大鼠肺癌中缺失表达 ;p16蛋白表达的阳性率在对照组及癌前病变与肺癌相比差异有极显著性 (P <0 .0 1) ;浸润癌与原位癌相比 ,p16蛋白阳性率的差异有显著性 (P <0 .0 5 )。CyclinD1、CDK4的表达在对照组较弱或阴性 ,而在实验组有不同程度的过表达 ,阳性率范围分别为 10 .0 0 %～ 79.0 7%、15 .0 0 %～ 72 .0 9% ;在不典型增生与原位癌、原位癌与浸润癌之间 ,cyclinD1和CDK4表达的升高有显著性 (P <0 .0 5 )。大鼠肺癌癌变中p16与cyclinD1呈负相关 (P <0 .0 1) ,Pearson列联系数为 0 .5 30 7;CDK4与CyclinD1呈正相关(P <0 .0 1) ,Pearson列联系数为 0 .5 782 ;p16与CDK4无明显相关性 (P >0 .0 5 )。p16、CyclinD1、CDK4与大鼠肺癌发?     

上皮细胞钠通道α亚基在大鼠和人睾丸、精子中的表达及其与精子活力的关系

目的:研究上皮细胞钠离子通道α亚基(ENaC-α)在大鼠和人的睾丸、精子上的表达及其与人精子活力之间的关系。方法:用western-blot检测ENaC-α在大鼠和人睾丸、精子上的表达,同时免疫荧光检测其在大鼠睾丸的分布特点。用计算机辅助精液分析检测ENaC-α的特异阻断剂EI-PA[5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride hydrochloride]对精子活力的影响。结果:ENaC-α亚基表达于大鼠睾丸精母细胞、精子细胞,以及大鼠成熟精子的鞭毛中段;它也存在于人睾丸和成熟精子的鞭毛中段。体外精子活力实验表明,获能过程中ENaC的阻滞,可以促进人精子活力的增加,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:ENaC-α构成的离子通道在生精细胞中表达,最终局限分布于成熟精子的鞭毛中段的质膜中。而特异阻断剂EIPA可以抑制上皮细胞钠离子通道,从而提高精子活力。     

不育男性精子DNA碎片指数与年龄和精液参数相关性分析

目的:通过对男性不育患者进行精子染色质结构分析(SCSA),探讨精子DNA碎片指数(DFI)与不育患者年龄、精子浓度及精子活率之间的关系。方法:531份精液样本来自2016年1月至2017年6月在武汉同济生殖医学专科医院就诊的男性不育患者。用计算机辅助精液分析系统(CASA)对精子浓度、活率和精液体积等参数进行常规分析,同时利用流式细胞术检测精子DFI,并分析精子DFI与受检者的年龄、精子浓度及精子活率的相关性。结果:随着患者年龄的增加,患者中精子DFI≤15%的比例明显减少,精子DFI≥25%的比例明显增加,21~30岁、31~40岁、41~52岁年龄组患者精子DFI≤15%分别为83.8%、47.8%、20.3%,精子DFI≥25%分别为8.8%、14.5%、72.9%,相关性分析表明患者年龄与精子DFI成正相关关系(r=0.653,P0.01)。而随着患者精子浓度和精子活率的增加,患者中精子DFI≤15%的比例明显增加,15%精子DFI25%和精子DFI≥25%的比例明显减少,相关性分析表明精子浓度、精子活率分别与精子DFI成负相关(r=-0.246,P0.01;r=-0.406,P0.01)。结论:精液中精子DFI与患者年龄、精子浓度及精子活率均显著相关,精子DFI可以作为评估精液质量的一个重要指标。综合分析精子DFI及精液常规参数能够对男性生育力进行更全面的评估。     

卵泡抑素样蛋白1在不明原因稽留流产患者血清、绒毛与蜕膜组织中的表达及意义

目的探讨不明原因稽留流产患者外周血和绒毛蜕膜组织卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)的表达及其临床意义。方法选取2014年1月-2015年12月我院诊治的不明原因稽留流产患者30例为实验组(n=30),另选取自愿要求终止妊娠的健康早孕妇女30例为对照组(n=30)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测两组外周血中FSTL1水平,通过先进的荧光定时PCR技术,检测两组绒毛、蜕膜组织中Fstl1 mRNA的表达水平。结果实验组血清FSTL1高于对照组,差异具有统计学意义(t=10.63,P0.001);实验组绒毛蜕膜组织中Fstl1 m RNA的表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论不明原因稽留流产患者血清及绒毛蜕膜组织中FSTL1表达水平明显升高,FSTL1可能在稽留流产发生发展中有一定作用。     

异丙苯过氧化氢体内致大鼠睾丸和附睾过氧化的初步研究

目的:建立异丙苯过氧化氢(cHP)体内过氧化模型,探讨cHP体内过氧化对大鼠睾丸组织和附睾精子的影响,及对精子核DNA断裂的影响。方法:90日龄雄性W istar大鼠52只,设cHP 1/10 LD50、1/6 LD50、1/4 LD503个剂量组和对照组,cHP 1/10 LD50、1/6 LD50组和对照组每组大鼠12只,1/4 LD50组大鼠16只。用无菌生理盐水稀释70%cHP水剂配制,按2 m l/kg经腹腔每日1次注射,对照组给同体积生理盐水,观察一般中毒症状和体征。连续1周,最后1次给药24 h后处死动物。分光光度法测定睾丸组织匀浆、附睾头部和尾部精子丙二醛含量,用单细胞凝胶电泳检测睾丸生精上皮细胞、附睾头部和尾部精子核DNA断裂发生率,计数附睾尾部精子活动率,睾丸和附睾常规石蜡切片,苏木精-伊红染色观察病理变化。结果:给予cHP大鼠活动稍差,无死亡,1/6 LD50、1/4 LD50 cHP组体重降低明显(P<0.001)。1/6 LD50、1/4 LD50 cHP组大鼠睾丸和附睾精子丙二醛浓度均明显高于对照组,附睾尾部精子活动率均明显降低,睾丸生精上皮细胞和附睾头部精子核DNA断裂发生率明显高于对照组,附睾尾部精子核DNA断裂的发生率与对照组差异无显著性(P>0.05)。1/10 LD50 cHP组大鼠体重变化、睾丸丙二醛浓度、附睾尾部精子活动率、睾丸生精上皮细胞和附睾精子核DNA断裂与对照组比较,差异均无显著性(P>0.05)。结论:1/6 LD50、1/4 LD50 cHP能在体内使大鼠睾丸和附睾精子发生过氧化,并使细胞核DNA发生断裂,核DNA断裂的主要部位可能在睾丸组织,对附睾尾部精子核DNA断裂无明显影响。     

奥硝唑对大鼠精子的影响及作用机制探讨

目的: 探讨奥硝唑降低大鼠精子活动力的影响因素及作用机制。　方法: 20只SD大鼠随机分为低剂量组(n=5)、高剂量组(n=8)和正常对照组(n=7)。低剂量组和高剂量组分别给予 200、400mg/kg奥硝唑灌胃,正常对照组给予0. 5%羧甲基纤维素钠灌胃,连续 20d。末次给药 24h后戊巴比妥钠麻醉,取附睾及睾丸,观察精子密度、精子活动力;检测睾丸、附睾组织匀浆中乳酸脱氢酶、α 葡糖苷酶、丙二醛、果糖的浓度变化。观察睾丸与附睾有无形态学改变。　结果: 奥硝唑 200、400mg/kg,连续灌胃给药 20d,能显著降低精子活动力(P<0. 01),对精子密度无明显影响(P>0. 05)。与正常对照组比较,高剂量组乳酸脱氢酶水平明显降低 (P<0. 01),丙二醛含量明显升高(P<0. 05)。　结论: 奥硝唑通过增加细胞脂质过氧化产物丙二醛,抑制附睾中的能量转换酶或非蛋白类物质使精子细胞受损、活动力降低,这是奥硝唑致弱精子症动物模型的作用机制之一。