CRISPR/Cas9系统靶向沉默Fas基因在肝衰竭细胞凋亡机制中的作用

目的探讨利用CRISPR/Cas9敲除系统沉默Fas基因介导的细胞凋亡在肝衰竭发生机制的作用。方法构建靶向Fas基因的CRISPR/Cas系统(pX330-Fas-G1)质粒并转染HepG2细胞(设非转染细胞HepG2为对照组),提取DNA后T7E1酶切法检测突变体;Western blotting检测Fas蛋白的表达。刀豆素A药物处理后MTT法检测细胞增殖,克隆增生法检测细胞增生,AnnexinV/PI荧光双染分析细胞凋亡情况。结果 T7E1酶切分析显示,pX330-Fas-G1质粒的Guide RNA在Fas基因组上产生了有效切割,切割效率为50%;同时Western blotting检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染至HepG2细胞后,与空白质粒pX330-GFP组比较,Fas蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P0.01)。经刀豆素A药物诱导细胞凋亡后,MTT法测定pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组活力值为(68.0±5.0)%,高于非转染细胞组的(51.5±5.8)%,差异有统计学意义(P0.05);克隆增生法检测结果显示,pX330-Fas-G1质粒转染的HepG2细胞组在细胞克隆形成数量为(128.8±5.1),高于非转染组的(100.0±9.3),差异有统计学意义(P0.05)。给予刀豆素A药物处理诱导细胞凋亡后,通过Annexin V和PI双染色,采用流式细胞技术检测显示,经pX330-Fas-G1质粒转染后的细胞组有10.0%的细胞为凋亡细胞,低于对照组细胞的33.3%,差异有统计学意义(P0.01)。结论 CRISPR/Cas9系统可通过下调Fas基因的表达来抑制细胞凋亡的进展,为临床开展急性肝衰竭的基因治疗提供理论依据和技术支持。     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0.02%胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞,光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态,自动生化仪定期检测培养肝细胞功能,RT-PCR半定量方法检测白蛋白mRNA,高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数(2～3)×108cells/整肝,活力和纯度大于95%,生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降,加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平,白蛋白合成在第3～4天达到高峰,培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Percoll分离液纯化以及HepatoZYME-SFM无血清培养基培养,肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

糖尿病患者呼出气冷凝液中亚硝酸盐水平变化及意义

目的观察2型糖尿病患者呼出气冷凝液（EBC）中亚硝酸盐（NO2-）的改变情况。方法选择16例2型糖尿病和20例健康非吸烟者,用Rtube收集器收集EBC,用NO检测试剂盒及分光光度法检测EBC中的NO2-浓度,同时检测肺功能。结果 2型糖尿病患者EBC中NO2-浓度高于健康对照组（P〈0.01）,两组肺功能第1秒用力呼气容积占预计值的百分比、CO肺弥散量占预计值的百分比比较均有统计学意义（P〈0.05或0.01）。结论 NO2-在2型糖尿病患者肺功能损害发病中可能起重要作用。     

C反应蛋白检测在COPD急性加重期的诊断价值

目的探讨C反应蛋白（CRP）在慢性阻塞性肺疾病（COPD）的急性加重期临床价值。方法检测慢性阻塞性肺疾病的急性加重期细菌感染的86名患者人院后第l、3d及出院前1dCRP,WBC,ESR,同时观察日体温和咳嗽频率、程度、痰颜色,同时给予抗生素治疗,并比较治疗前后这些指标的变化情况。结果 C反应蛋白在患者入院时的阳性率为100%,明显高于其他常规指标,在治疗后,CRP在常规检测指标还未有显著变化时已经明显下降,并与临床的症状相一致,其治疗前后的差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论 CRP在COPD急性加重期是一个良好的观察指标,可反映抗生素的即时疗效,比WBC,ESR更快速且敏感。     

呼出气冷凝液中8-异前列腺素水平检测对咳嗽变异性哮喘的临床意义

目的探讨8-异前列腺素检测对诊治咳嗽变异性哮喘(CVA)的临床意义。方法选取50例CVA患者和30例健康对照纳入研究,所有受试者测定呼出气冷凝液中8-异前列腺素水平并进行肺功能检测。结果与健康人群相比,CVA患者EBV中8-iso-PG水平显著升高(P0.01);治疗前后比较,CVA患者EBV中8-iso-PG水平明显降低(P0.01),而FEV1%检测差异无统计学意义。EBV中8-iso-PG水平与FEV1%检测值之间无相关性(r=-0.17,P0.05)。结论 EBC中8-iso-PG检测可直观反映CVA患者存在的气道氧化应激状态,并能较好的预测治疗敏感性,从而有助于CVA患者的早期诊断和疗效预判。     

胃肠手术后患者发生肺部并发症的危险因素分析

目的：探讨胃肠手术后患者发生肺部并发症（PPC）的危险因素。方法：回顾性分析852例胃肠手术后患者的临床资料,分为PPC组和非PPC组,比较两组患者66个观察项目的差异性,并进行Logistic回归分析。结果：206例胃肠手术患者术后肺部并发症的发生率为24.2%（206/852）,单因素Logistic回归分析筛选出31个危险因素,多因素分析显示年龄（OR=1.051）、伴存呼吸疾病（OR=2.942）、术前血清白蛋白水平（OR=0.977）、术前抗生素使用时间（OR=1.068）、术中气管插管时间（OR=1.003）、保留鼻胃管时间（OR=1.055）、术后机械通气时间（OR=1.939）为发生PPC的危险因素。结论：高龄、术前伴存呼吸疾病、血清白蛋白水平低于正常、术前长时间使用抗生素、术中气管插管时间、保留鼻胃管时间、术后机械通气时间长的胃肠手术患者易发生肺部并发症。     

miR-122慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的作用

目的构建慢病毒载体并探讨稳定表达的miR-122在肝癌细胞中的作用。方法将miR-122的前体克隆到慢病毒载体pLUNIG上获得稳定表达miR-122的病毒载体,在293T细胞内进行包装,浓缩获得病毒上清。用病毒上清去感染肝癌细胞HepG2,采用MTT法及克隆增生检测对肝癌细胞增殖的影响,并设空载体组为对照进行分析。各组间均数采用t检验。结果慢病毒质粒Lv-miR122经包装浓缩后收获的病毒上清有效的感染肝癌细胞且miR-122表达显著上调,与慢病毒空载体对照组（Lv-Ctrl）相比,差异具有统计学意义（t=10.745,P〈0.01）;稳定表达的miR-122能明显抑制肝癌细胞的增殖,与Lv-Ctrl和HepG2对照组相比差异有统计学意义（P均〈0.05）;而且miR-122能明显抑制肝癌细胞的克隆增生（t=-5.256,P〈0.01）。结论成功的构建了稳定表达miR-122的慢病毒质粒,并使携带的miR-122能稳定表达且具有抑制肝癌细胞增殖的活性。     

重症监护室呼吸机相关性肺炎的危险因素和病原菌分析

目的 探讨重症监护室(ICU)患者呼吸机相关性肺炎(VAP)的危险因素、病原菌的构成、耐药性及控制措施.方法 对ICU收住的110例机械通气患者中VAP的发生情况、相关因素及病原菌培养结果进行回顾性调查分析.结果 VAP的发病率为47.27%,其中年龄、制酸药、机械通气时间、意识障碍、抗生素的联合应用、基础疾病是医院获得性肺炎的重要危险因素,52例VAP以G-菌感染为主(64.13%),其次为G+菌(22.83%)和真菌(13.04%),病原菌存在多重耐药性.结论 危险因素的存在与VAP的发生密切相关,VAP患者感染的主要致病菌为G-菌,且存在明显的耐药情况.