用Red介导的同源重组结合酶切改构质粒DNA

目的：用Red介导的单链寡核苷酸体内同源重组结合限制酶切方法对pBR322-Red质粒中的DNA序列进行精确的缺失突变。方法：用合成的单链寡核苷酸打靶分子电击转化W3110(pBR322-Red)宿主菌，利用Red提供的同源重组功能敲除从kil基因至Ⅳ基因长约2100bp的DNA序列，并用kil-N序列中含有的单一酶切位点Xho Ⅰ对混合质粒进行酶切，取酶切产物转化W3110感受态细胞，菌落PCR方法筛选重组阳性克隆。结果：在没有任何筛选标记的情况下，用菌落PCR方法从10个菌落中成功挑选出1个重组阳性克隆。结论：该方法操作简单、精确，能够避免引入新突变。为DNA序列的缺失突变提供了一种新方法。     

应用Red重组工程技术在大肠杆菌外膜展示表达外源蛋白

目的 将外源蛋白或抗原稳定表达展示于大肠杆菌的外膜上.方法 应用大肠杆菌DY330介导的重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术,将长度为1653 bp的荧光素酶报告基因(luc)敲入DY330染色体与外膜蛋白基因lpp、ompA融合.结果 报告基因定量分析结果址明:外源荧光素酶(luciferase,Luc)能够与外膜蛋白融合表达于细菌外膜,Lpp-OmpA-Luc融合蛋白表达于细菌外膜的效率最高.结论 外源蛋白能够稳定表达于细菌外膜,不会影响细菌的生长繁殖.     

西黄丸抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的分子机制研究

目的探讨西黄丸水提液抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的分子机制.方法通过细胞划痕实验分析不同浓度(5、7.5、15 g/L)西黄丸水提液对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响.利用表皮生长因子(EGF)单独或联合加入西黄丸水提液,作用于乳腺癌MDA-MB-231细胞,通过蛋白质印迹法检测纤维连接蛋白(FN...     

西黄丸联合紫杉醇抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用机制研究

目的研究西黄丸(Xihuang wan,XHW)联合紫杉醇(paclitaxel,PTX)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、凋亡的影响及其分子机制。方法首先,通过低温浸提法获得西黄丸浸液,用不同浓度的西黄丸浸液单独或联合紫杉醇处理MDA-MB-231细胞系,通过CCK8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测其凋亡的变化,ELISA检测细胞上清中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)含量。结果单独使用西黄丸即可抑制MDA-MB-231增殖,联用紫杉醇抑制细胞增殖效果更明显;单用西黄丸可诱导MDA-MB-231凋亡,联用紫杉醇诱导凋亡效果也可获得提高;紫杉醇会诱导细胞外液中PGE2含量升高,联用西黄丸可降低升高的PGE2。结论西黄丸联合紫杉醇可更好地诱导人乳腺癌细胞系MDA-MB-231发生凋亡并抑制其增殖,同时还可以抑制受紫杉醇诱导而升高的PGE2,这可能是西黄丸联用化疗药防止肿瘤复发、转移的重要分子机制之一。     

boxA及上游序列缺失突变对λ噬菌体抗转录终止功能的影响

目的 研究λ噬菌体表达调控机理，阐明PL操纵了boxA及邻近序列突变对抗转录终止作用的影响。方法 利用体内同源重组技术，使大肠杆菌染色体DNA上携带了CI857，PL，nutL[boxA*(*代表不同的boxA及临近序列缺失突变）,boxB],N-lacZ,ttt,galK单拷贝基因，构建了含boxA及邻近序列突变（boxA*)的一系列新菌株，模拟了λ噬菌体感染宿主菌后的生理状态，利用抗转录终止报道基因galK分析研究了boxA及临近序列突变对PL操纵子抗转录终止作用的影响。结果 证明在缺失了boxA及部分上游序列的情况下，大肠杆菌RNA聚合酶不能通读转录终止子。结论 λ噬菌体左向操纵子具有与右向操纵子不同的转录调控现象。     

抑制细丝蛋白A促进前列腺癌C4-2细胞迁移

目的 探讨细丝蛋白A(FLNA)对前列腺癌细胞迁移的影响。方法 设计并构建靶向FLNA的shRNA敲低质粒pSIH-H1-shFLNA。包装慢病毒后感染前列腺癌C4-2细胞,获得敲低FLNA的稳定细胞系C4-2-shFLNA。Western印迹检测前列腺癌C4-2细胞中FLNA蛋白表达和PC-1蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测FLNA以及PC-1 mRNA表达水平;Western印迹检测敲低FLNA对磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B(AKT)信号通路的影响;划痕实验和Transwell实验检测C4-2细胞体外迁移能力。结果 前列腺癌C4-2细胞敲低FLNA后FLNA mRNA和蛋白水平明显下调,PC-1 mRNA水平和蛋白水平表达增加,同时AKT磷酸化水平显著升高。划痕及Transwell实验证实在前列腺癌C4-2细胞中敲低FLNA后细胞迁移能力增强。结论 前列腺癌细胞中敲低FLNA能够激活PI3K/AKT信号通路,促进前列腺癌细胞迁移。     

端粒酶反义寡核苷酸对膀胱癌T24细胞的作用

目的 探讨全硫代修饰的端粒酶反义寡核苷酸（ASODN-t)抑制人膀胱癌T24细胞增殖并诱导其凋亡的可能性。为膀胱癌基因治疗提供新靶点。方法 采用光镜、电镜、四唑盐比色（MTT）法及流式细胞术等检测不同浓度（2-10umol/L)ASODN-t对T24细胞生长、细胞周期和诱导其凋亡的作用。结果 不同浓度ASODN-t对T24细胞生长有抑制作用。且具有序列特异性及剂量依赖性,6umol/lASODN-t作用细胞72h,电镜观察可见典型凋亡特征,流式细胞仪检测到凋亡峰,凋亡率为10.4%,而无关寡核苷酸（N-ODN）则无此作用。结论 ASODN-t对T24细胞生长有抑制作用,可诱导其发生凋亡,说明端粒酶与T24细胞恶性增殖有关。抑制端粒酶活性可能成为膀胱癌基因治疗的新靶点。