携带人衰变加速因子基因转基因小鼠的建立

目的 通过建立转人衰变加速因子（ＤＡＦ）基因小鼠,为研究异种器官移植的超急性排斥反应提供有效的研究手段。方法 采用受精卵显微注射技术,将人ＤＡＦ基因导入小白鼠受精卵的原核中,Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交确定阳性围基因小鼠。以Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交法检测人ＤＡＦ基因的表达情况。结果 基因注射后共生出小鼠２４只,４只为转基因小鼠,人ＤＡＦ基因在其中１只小鼠体内得到表达,结论 所导入ＤＡ     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力

目的:检测血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠抗超急性排斥反应能力。方法:采用Langendorff心脏灌注装置,用20%稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏,观察其抗超急排斥反应能力。免疫组化方法检测灌注后心脏组织人IgM沉积情况。结果:与普通鼠对比,转基因小鼠离体心脏在用20%稀释人血清灌注期间心脏存活时间明显延长,且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20%以上,显示转基因小鼠具有一定抗超急排斥反应能力。免疫组化显示C3c(免疫组化一抗)在转基因组心肌组织间、血管管壁仅有少量沉积,普通小鼠组大量沉积,显示普通小鼠心脏遭受较为强烈的超急排斥反应损伤。结论:血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠有一定的抗超急排斥反应能力。     

核定位信号肽在异种移植动物模型转人α1,2-岩藻糖苷转移酶基因小鼠制备中的作用

目的探讨核定位信号肽（NLS）在转人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）基因小鼠制备中的作用。方法将受精卵随机分为3组，采用显微注射的方法制备转基因小鼠。实验组：将NLS转基因构件与人HT转基因构件同时导入细胞质；对照Ⅰ组：将人HT转基因构件导入细胞质；对照Ⅱ组：将人HT转基因构件导入细胞核。应用聚合酶链反应（PCR）、Southern杂交及逆转录（RT）-PCR等方法检测人HT基因在G0代小鼠体内的整合与表达，应用流式细胞计数（FCM）检测转基因小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面H抗原与α-Gal抗原的表达。结果实验组与对照Ⅰ组G0代小鼠的出生率33．8%（46／136）及35．4%（23／65）高于对照Ⅱ组10．2％（51／498）（P〈0．01），实验组人HT基因的整合率（30．4%，14／46）高于对照Ⅰ组（0，0／23）与对照Ⅱ组（11．8%，6／51，P〈0．01），实验组人HT基因的表达率（19．6%，9／46）也高于对照Ⅰ组（0，0／23）和对照Ⅱ组（5．9%,3／51，P〈0．01），人HT mRNA在小鼠心、肝、肾和骨骼肌组织中均表达阳性。转基因小鼠PBMCs表面H抗原表达阳性，表达强度为人的85％～190%，同时α-Gal抗原表达显著降低。为正常小鼠的5%～12％。转基因小鼠已经稳定传3代。结论NLS基因与目的基因细胞质共注射是制备转基因小鼠简便实用的新方法。     

建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子的转基因小鼠

目的为了研究异种移植，建立血管内皮细胞组织特异性表达人衰变加速因子(DAF)的转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人内皮细胞粘附分子-2(ICAM-2)基因启动子、人DAF cDNA(插有人DAF基因第一个内含子)、SV40splice／polyA的外源基因导人小鼠受精卵的原核中；选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链(PCR)技术及Southern印迹杂交法确定外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和流式细胞术分别用于外源基因mRNA及蛋白质水平表达的检测。免疫组织化学方法观察人DAF在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官的表达分布。采用Langendorff心脏灌流装置，用200g／L的稀释人血清灌注转基因小鼠离体心脏，检测其抗超急性排斥反应能力。结果共产仔鼠133只，21只整合有外源基因，整合率16％(21／133)。8只实现mRNA及蛋白质水平表达，蛋白质水平表达强度为人DAF基因在人白细胞表达强度的70％至95％，转基因效率60A(8／133)。免疫组织化学法显示人DAF在转基因小鼠器官组织切片上有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。与普通鼠对比，转基因小鼠离体心脏存活时间明显延长，且60min灌注期间内做功仍维持在最大值20％以上。结论成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人DAF的转基因小鼠。这种小鼠有一定的抗超急性排斥反应能力。     

联合转移人HT和DAF基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用

目的探讨联合转移人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用。方法通过显微注射制备转人HT及DAF基因的子代小鼠，以聚合酶链反应和流式细胞仪筛选出人HT和（或）DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。以同时表达人HT和DAF基因的小鼠为实验组，单一表达人HT或DAF基因的小鼠为HT对照组和DAF对照组，取其心脏，采用改良的Langendorff心脏灌注装置灌注心脏，先以KH液逆向灌注，30min后再以含15％（体积分数）人AB血清的Krebs—Henseleit液（KH液）灌注。记录不同灌注时间的心率、左心室收缩压及左心室舒张末压，计算左心室获得压，以心率与左心室获得压的乘积作为心脏左心室收缩功能的指标，免疫组化法观察灌注后的心脏血管内皮细胞和组织中IgM与C3c的沉积情况。结果KH液灌注过程中，各组间心脏做功能力的差异无统计学意义；KH液中加入人血清后，HT对照组和DAF对照组的心脏做功能力明显下降，在灌注60min时心脏做功分别为最大值的27％和23％，平均做功时间分别为118min和89min，普通小鼠心脏在灌注后50min时停止搏动，而实验组的心脏做功能力下降缓慢，至60min时心脏做功维持在最大值的67％以上，平均做功时间为225min，其心脏做功能力与搏动时间高于HT对照组和DAF对照组（P〈0．05）。免疫组化染色显示，实验组小鼠心脏血管内皮细胞与组织中未见IgM和C3c沉积，HT对照组可见C3c少量沉积，DAF对照组可见IgM沉积和C3c少量沉积，普通小鼠心脏可见IgM和C3c沉积。结论小鼠联合转移人HT和DAF基因后，其心脏在人血清灌注下的免疫损伤明显减轻，这可能对抵御异种移植超急性排斥反应有一定帮助。     

山羊细胞核移植

哺乳动物细胞核移植是研究哺乳动物发育与遗传以及优良品种繁育的一个重要途径。它使人们能够在一个繁殖周期内获得大量与亲本遗传性状完全一致的复制后代。哺乳动物核移植已在小鼠、兔、绵羊、猪、牛上获得后代,但山羊核移植报道较少。张勇(1991)报道获得了4—32细胞期胚胎分裂球的核移植后代。 本研究采用白山羊为核移植的供体细胞核,青山羊为核移植的供体细胞质。将白山羊8细胞期胚胎的分裂球移入去核的青山羊 成熟卵母细胞的卵周隙内,经电融合、CB培养,然后将重构胚胎移植到假孕青山羊输卵管内,经161天妊娠,产出两只雌性核移植后代。经羔羊毛色鉴定,一只核移植后代毛色为纯白色,证明来源于白山羊8细胞期胚胎分裂球,即山羊8细胞期胚胎的单个分裂球仍具有发育全能性。另一只核移植后代,在眼、鼻、背线和腕关节处有青山羊毛色特征,其余均为白山羊特征,其形成原因正在研究中。     

异种移植血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠的建立

目的建立用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人ICAM-2启动子、人CD59基因第1个内含子、人CD59 cDNA、BGH polyA终止信号的外源基因导入小鼠受精卵的原核中。选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链反应（PCR）及Southern blot确定外源基因整合阳性转基因小鼠。流式细胞术用于外源基因蛋白质水平表达检测。免疫组织化学方法观察人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果产仔130只，9只外源基因整合阳性。整合率6％（9／130）。6只获得蛋白质水平表达。蛋白质水平表达强度为人CD59在人白细胞表达强度的80％至95％，转基因效率5％（6／130）。免疫组织化学检测显示人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏组织有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。结论成功地建立了用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。     

人α1,2-岩藻糖苷转移酶和衰变加速因子基因转移克服异种移植急性血管排斥反应的研究

目的 观察人α1,2-岩藻精苷转移酶(HT)和衰变加速因子(DAF)基因转移对抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力.方法 通过显微注射建立转基因小鼠动物模型,Southern印迹杂交和流式细胞汁数筛选出人HT和/或DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠.研究表达不同目的 基因的转基凶小鼠血管内皮细胞与15%人血清孵育后溶破细胞的百分数,免疫细胞化学染色检测细胞核因子(NF)-κB的激活,流式细胞计数检测细胞表面血管细胞黏附分子(VCAM)-1的表达.结果 子代小鼠血管内皮细胞人HT/DAF共基因表达7只,人HT与DAF单基因表达分别为6只和8只.与15%人血清孵育后,人HT/DAF共表达组细胞的溶破细胞百分数(4±2)%低于人HT表达组细胞(25±10)%、人DAF表达组细胞(31±11)%及正常组细胞(76±24)%(P均＜0.05).转双基因抑制细胞NF-κB激活的能力强于转入HT或DAF单基因,且转双基因细胞表面VCAM-1的表达较转单基因细胞显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人HT/DAF基因联合转移具有部分抑制血管内皮细胞激活从而克服异种移植急性血管排斥反应的能力.     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测

探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法：将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠，与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern-blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果：产子14只。7只外源基因整合阳性，其中雄性4只，雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测，白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论：转基因动物的遗传规律复杂，基因沉默可能是导致子代转基因动物不表达的重要因素。