生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

背景:生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子.克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础.目的:利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性.设计、时间及地点:基因水平观察实验,于2006-01,06在南方医科大学分析测试中心完成.材料:人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意.10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18-22 g,6～8周龄.方法:通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达.凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定.主要观察指标:琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDD-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性.结果:RT-PCR产物长约350 bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350 bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14 100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量13 600接近.纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞.结论:通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性.     

大鼠坐骨神经再生过程中的神经元轴突自噬作用

目的探讨大鼠坐骨神经变性轴突清除中的自噬作用。方法横切大鼠坐骨神经制作Wallerian变性模型,造模后不同时间点取远断端组织行电镜结构观察和酸性磷酸酶(AcPase)活性检测。结果坐骨神经横切后轴突发生变性,主要变化为术后第5小时~2天轴质肿胀,轴突与髓鞘分离,术后第4天轴质浓缩,轴突与髓鞘完全分离形成游离轴突体。术后初期变性轴突主要形成大小不等的空泡,后期轴突与髓鞘完全分离并形成较大的游离轴突体,轴突体外包一层轴突膜是神经元细胞膜的延续,轴突体轴质浓缩,含大量各级自噬泡和纵横交错的神经丝、微管和微丝。经酸性磷酸酶(AcPase)染色证实自噬泡均呈AcPase阳性,第7天后轴突体被降解吸收,形成的空腔内偶见巨噬细胞。结论大鼠坐骨神经再生过程中变性轴突的清除主要靠轴突自身的自噬和施万细胞吞噬机制,而巨噬细胞只起辅助作用。     

生物可吸收高强度固态压缩聚丙交酯的降解特征和强度维持

用特殊的加热压缩方法固态压缩法 (solid statecompression ,SC)加工左旋聚丙交酯 (poly L lac tide ,PLLA) ,获得高强度SC PLLA(弯曲强度 2 5 0Mpa,剪切强度 190Mpa)。将SC PLLA棒 (3.2mm× 30mm) ,置于PBS液或植入兔的皮下和股骨内 ,定期观察粘均分子量、结晶度、扫描电镜 (SEM )形态和机械性能 (弯曲强度和剪切强度 ) ,研究该材料的降解特征和强度特性 ,以评价其作为矫形外科骨固定装置材料的价值。结果表明 ,各组分子量在前 12周下降迅速 ,其后缓慢下降 ,至 72周时 ,各组分子量降解 98%以上 ;结晶度则与此相反 ,12周内上升迅速 ,36周达最大。SEM见SC PLLA降解前内部有大量排列整齐的纵向纤维 ,并随降解而破坏并出现孔隙。SC PLLA降解 2 4周后 ,各组的弯曲强度仍维持在 180MPa以上 ,剪切强度在 75MPa以上 ,都大于皮质骨强度 ,提示材料的强度维持时间满足一般的骨内固定要求。因此SC PLLA是一种有前途的生物可吸收接骨材料     

生物可吸收高强度左旋聚丙交酯材料在体内的力学特征

目的观察生物可吸收固态压缩法增强的、高强度左旋聚丙交酯poly-L-lactide,PLLA材料在体内的力学变化特征,评价其作为骨固定装置材料的价值. 方法用特殊的加热压缩方法-固态压缩法(solid-state compressionSC)加工左旋聚丙交酯,得SC-PLLA试棒(3.2mm×30mm),植入兔的皮下和股骨内,在长达48周的降解时间里,观察材料的力学性能(弯曲强度和剪切强度)和扫描电镜(SEM)下的微观形态. 结果植入24周后,各组SC-PLLA在体内的力学强度均可维持在弯曲强度180Mpa以上,剪切强度75Mpa以上,它们都大于皮质骨强度.剪切强度的下降比弯曲强度快.SEM见SC-PLLA降解前内部有大量排列整齐的纵向纤维,并随降解而破坏并出现孔隙. 结论固态压缩法可获得高初始强度和维持强度的PLLA,满足一般的骨内固定要求.SC-PLLA是一种有前途的生物可吸收接骨材料.     

双重免疫胶体金标记组织中肥大细胞内分泌颗粒的超微结构

目的：观察肥大细胞分泌颗粒内特异性酶的分布及其超微结构，并探讨肥大细胞的功能。方法：用双重免疫胶体金标记类胰蛋白酶抗体（AA5）及类糜蛋白酶抗体（CC4），在透射电子显微镜下观察肥大细胞内分泌颗粒的超微结构。结果：在肥大细胞内分泌颗粒中富集类胰蛋白酶和（或）类糜蛋白酶，多数酶蛋白呈细小球形结构；在细胞膜内侧分泌颗粒融合形成分泌通道，细胞的外侧可见肥大细胞脱出的颗粒；细胞内的另侧分泌颗粒呈球形小泡。结论：肥大细胞内酶蛋白的富集可为肥大细胞参与Ⅰ型变态反应提供物质基础。     

抑制性消减杂交法筛选植入人发角蛋白与单纯脊髓损伤大鼠基因表达的差异

目的:采用抑制性消减杂交筛选植入人发角蛋白大鼠损伤脊髓基因性差异表达。方法:实验于2004-11在汕头大学中心实验室进行。分别从植入人发角蛋白损伤组与单一损伤对照组4thw组织中提取mRNA,反转录成双链cDNA,经RsaI酶切、接头连接、两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链扩增,而后将消减cDNA产物进行T/A克隆和测序分析。结果:所获植入人发角蛋白脊髓损伤组织差异表达基因的消减cDNA产物散布在280～800bp范围。经蓝白筛选和酶切鉴定,共得到232个阳性克隆。对其中20个做测序分析获得了氨基酸转运蛋白系统A2(Ata2)、细胞色素氧化酶Ⅲ(COXⅢ)、抗过氧化物蛋白5(Prd5)、Tap1蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cst3)等5个表达蛋白。结论:prd5、Ata2和COXⅢ分别通过参与脊髓损伤后抗氧化损伤过程,起到抑制自由基、兴奋性氨基酸的产生,减轻Ca离子紊乱的程度,降低了继发性损害对脊髓组织的二次损伤程度;而Tap1蛋白和Cst3则参与人发角蛋白的降解过程。     

大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用

背景：Wallerian变性时髓鞘溃变碎片的清除对于神经的再生至关重要，但溃变碎片的清除机制一直没有彻底阐明，关于参与清除的细胞成分类型仍有很大争议。目的：探讨大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用。设计：完全随机自身对照研究。地点和对象：本实验由第一军医大学解剖教研室、汕头大学医学院中心实验室和西南大学达拉斯医学中心精神病学部共同完成，研究对象为成年Wistar大鼠30只，雌雄各半，体质量180—250g。干预：横切大鼠坐骨神经制作Wallerian变性模型，分别于造模后0，0．5，1，1．5，2，3，4，5，7，10，15d取远断端组织行电镜观察。主要观察指标：电镜观察轴突和髓鞘的超微结构，Gomori染色后检查酸性磷酸酶活性。结果：轴突在第0．5天时从髓鞘脱离，溃变呈空泡状。第2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片，许旺氏细胞内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片，并与溶酶体融合形成自噬泡，呈酸性磷酸酶(AcPase)阳性。第4天时内膜区偶见幼稚细胞，1周后见大量幼稚细胞。第7天后许旺氏细胞内自噬泡数量开始减少。实验全程偶见巨噬细胞，内有吞噬泡。结论：大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经许旺氏细胞自噬清除，许旺氏细胞脱分化为许旺氏细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程。     

抑制性消减杂交法筛选植入人发角蛋白与单纯脊髓损伤大鼠基因表达的差异

目的：采用抑制性消减杂交筛选植入人发角蛋白大鼠损伤脊髓基因性差异表达。 方法：实验于2004-11在汕头大学中心实验室进行。分别从植入人发角蛋白损伤组与单一损伤对照组4^thw组织中提取mRNA，反转录成双链cDNA，经RsaⅠ酶切、接头连接、两次消减杂交和两次抑制性聚合酶链扩增，而后将消减cDNA产物进行T／A克隆和测序分析。 结果：所获植入人发角蛋白脊髓损伤组织差异表达基因的消减cDNA产物散布在280～800bp范围。经蓝白筛选和酶切鉴定，共得到232个阳性克隆。对其中20个做测序分析获得了氨基酸转运蛋白系统A2（Ata2）、细胞色素氧化酶Ⅲ（coxⅢ）、抗过氧化物蛋白5（Prd5）、Tap1蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cst3）等5个表达蛋白。 结论：prd5、Ata2和COXⅢ分别通过参与脊髓损伤后抗氧化损伤过程。起到抑制自由基、兴奋性氨基酸的产生，减轻Ca离子紊乱的程度。降低了继发性损害对脊髓组织的二次损伤程度；而Tap1蛋白和Cst3则参与人发角蛋白的降解过程。     

大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用

背景 Wallerian变性时髓鞘溃变碎片的清除对于神经的再生至关重要 ,但溃变碎片的清除机制一直没有彻底阐明 ,关于参与清除的细胞成分类型仍有很大争议. 目的 探讨大鼠坐骨神经再生过程中许旺氏细胞的自噬作用. 设计 完全随机自身对照研究. 地点和对象 本实验由第一军医大学解剖教研室、汕头大学医学院中心实验室和西南大学达拉斯医学中心精神病学部共同完成 ,研究对象为成年 Wistar大鼠 30只 ,雌雄各半 ,体质量 180- 250 g. 干预 横切大鼠坐骨神经制作 Wallerian变性模型 ,分别于造模后 0,0.5,1,1.5,2,3,4,5,7,10,15 d取远断端组织行电镜观察. 主要观察指标 电镜观察轴突和髓鞘的超微结构 ,Gomori染色后检查酸性磷酸酶活性. 结果 轴突在第 0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状.第 2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,许旺氏细胞内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶 (AcPase)阳性.第 4天时内膜区偶见幼稚细胞 ,1周后见大量幼稚细胞.第 7天后许旺氏细胞内自噬泡数量开始减少.实验全程偶见巨噬细胞 ,内有吞噬泡. 结论 大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经许旺氏细胞自噬清除,许旺氏细胞脱分化为许旺氏细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程.     

食管癌细胞诱导肥大细胞迁移的小鼠模型

目的建立小鼠肥大细胞 (mast cell, MC) 迁移模型,探讨化疗药物三氧化二砷对人食管癌EC109细胞株生长的杀伤机理。方法利用肥大细胞的特征性蛋白酶抗体及其免疫荧光标记MC和PI标记EC109细胞内DNA;以流式细胞术分析小鼠腹腔液中肥大细胞各亚型的百分率及肿瘤细胞周期变化;使用激光扫描共聚焦显微镜显示肥大细胞内分泌颗粒的分布。并通过组织化学方法,观察各种诱导处理后小鼠肠组织肥大细胞由肠道向腹腔移动的变化。结果① 根据流式细胞仪点图分布分析,将小鼠肥大细胞分为:类胰蛋白酶阳性、类糜蛋白酶阴性(MC T); 类糜蛋白酶阳性、类胰蛋白酶阴性(MC C)和类胰蛋白酶阳性、类糜蛋白酶阳性(MC TC)三种亚型,且T型MC明显多余TC型和C型(P<0.05);以共聚焦显微镜显示三种亚型的MC均含有丰富的分泌颗粒并分布于细胞膜内侧,为其出芽突起形成储备的状态。② 经组织切片观察到诱导处理后小鼠肠组织MC由肠道向腹腔移动,且胰酶对MC的诱导作用大于食管癌细胞和As₂O₃。③ 经诱导迁移入腹腔的MC可能与癌细胞周期由S期向G₂/M期跨越相关;As₂O₃能延迟食管癌细胞的G₀/G₁期,阻碍细胞向S期跨越,从而抑制食管癌细胞的生长。结论食管癌细胞移入小鼠腹腔,主要诱导T型MC参与免疫反应。在生物机体内环境(这里指MC影响)的条件下,As₂O₃对肿瘤细胞生长的作用主要表现为促使癌细胞周期的G₀/G₁期向S期跨越延迟,或G₂/M期进入细胞分裂的延迟。