pcDNA3-hBMP2基因转染成纤维细胞及其稳定表达

目的 探讨外源性hBMP2基因在成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 将hBMP2的cDNA连入真核表达载体pcDNA3,形成重组真核表达载体pcDNA3-hBMP2,在脂质体介导下,将其导入小鼠成纤维细胞株（NIH3T3）。通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养4周,然后用原位杂交和免疫组织化学方法检测BMP2基因在成纤维细胞NIH3T3内的稳定表达情况。结果 经原位杂交和免疫组织化学证实,转染 pcDNA3-hBMP2后的成纤维细胞NIH3T3内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达。结论 在脂质体介导下,hBMP2基因能够导入成纤维细胞内并在其内获得稳定表达。     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。