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1.
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础. 相似文献
2.
目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功. 相似文献
3.
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200~1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据. 相似文献
4.
目的:研究β2-m对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及β2-微球蛋白的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和β2-微球蛋白基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白(β2m)的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,核心启动子在β2-微球蛋白(β2_m)的影响下,其启动子活性降底2倍.结论:β2-微球蛋白(β2-m)明显HBV核心启动子的表达. 相似文献
5.
TTV是近年发现的一种新的DNA病毒,它在肝脏疾病中的致病作用尚未确定。国内外资料均表明,TTV在全世界有广泛的分布,而且在各种人群中有较高的感染率。为了解TTV在本地区各类肝炎患者及正常人群中的感染率,本室用ELISA方法对264份血清样品进行了TTV抗体的检测。其中乙型肝炎109份,丙型肝炎67份,正常人115份,非甲-戊型肝炎47份,阳性率分别为6.4%,6.0%,5.2%和19.1%。统计学分析结果表明,前三组TTV感染率相互之间没有显著性差异(P>0.05),而非甲-戊型肝炎组TTV感染率与前三组差异均非常显著(P<0.01),说明在既往病因不明的肝炎中,可能有一部分患者是由于TTV感染所致。但因所测定的病例数有限,TTV在肝脏疾病中的致病作用仍有待于进一步研究。 相似文献
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核孔复合体相互作用蛋白(NPIP)对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用 总被引:2,自引:0,他引:2
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乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制. 相似文献
8.
目的分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系。方法收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBV S基因并进行克隆测序,挑选代表性突变株病毒基因构建重组载体并进行表型分析。结果从该患者4份血清样本中检出多种S基因突变形式,包括前S1区大片段缺失、s126–127"RPCMNCTI"插入突变、sQ129N、s131–133 TSM→NST和经典的sG145R突变等,其中s131–133 TSM→NST在前后4份动态样本的检测病毒克隆中所占比例分别为0%、26%、59%和74%;前S1区大片段缺失在4份样本检测病毒克隆中始终存在,所占比例分别为26%、17%、15%和21%。表型分析发现,sQ129N和s131–133 TSM→NST可以降低抗体对HBsAg的亲和力,增加病毒分泌;与野生株相比,前S1区大片段(nt 3046–3177)缺失病毒株复制力下降了43.7%,表面抗原启动子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2%;sG145R可降低病毒的分泌能力。结论此例HBV感染患者的长期OBI临床表现是由于其感染有多种S基因突变病毒株引起,其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点,可能与肝脏疾病进展密切相关。 相似文献
9.
目的应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与丙型肝炎病毒非结构蛋白4A(HCV NS4A)相互作用的蛋白。方法连接有HCV NS4A酵母表达的载体pGBKT7-NS4A,转化入单倍体酵母细胞AH109,与转化了人白细胞cDNA文库质粒的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-a-半乳糖(X-a-Gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠埃希细菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析。对克隆重复率较高的蛋白编码基因进行克隆和回交验证。结果筛选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-a-gal的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落45个,其中钙离子信号调节亲环素配体(CAML)29个。对CAML基因成功克隆,回交验证了HCV NS4A与CAML的相互作用。结论成功筛选出7种在人白细胞cDNA文库中与HCV NS4A特异性相互作用的蛋白,为进一步探讨HCV的致病机制提供了新的线索。 相似文献
10.
目的 应用酵母双杂交技术筛选干扰素β(IFNp)结合蛋白。方法 用多聚酶链反应(PCR)技术扩增IFNB基因,连接酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal列)上进行双重筛选阳性克隆,提取酵母质粒后转化大肠埃希菌(DH5α)并经氨苄西林抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,进行酶切鉴定及序列测定,并进行生物信息学分析。结果 应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆29个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,最后得到19个克隆基因,编码14种已知蛋白和一种未知功能蛋白。初步发现铁蛋白与IFNB具有结合作用。结论 应用酵母双杂交技术筛选出多种与IFNB具有结合作用的蛋白。 相似文献