单顺反子表达人GM-CSF和B7.1融合基因真核表达载体的构建和鉴定

目的　构建单顺反子表达人 GM- CSF和 B7.1融合基因真核表达载体。　方法　应用巨引物 PCR技术对 h GM- CSF基因 c DNA进行定点突变 ;应用 PCR重叠延伸法 ,将 h GM- CSF和 h B7.1基因的 c DNA编码序列通过一 linker序列拼接 ,构建 h GM- CSF与 h B7.1融合基因 h GM- B7.1,将其插入 pc DNA3真核表达载体 ,测定核苷酸序列。　结果　序列分析表明 :(1) h GM- CSF突变体基因 c DNA编码序列的 178位核苷酸由 C变为 A,其余核苷酸序列均未发生变化 ;(2 ) h GM- CSF、linker、h B7.1的连接顺序、方向及序列完全正确。　结论　构建 pc DNA3- h GM- B7.1融合基因真核表达载体成功     

冠状动脉灌注TGF-β1基因对异基因大鼠心脏移植物急性排斥反应的影响

目的 探讨经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导转化生长因子-β1(TGF-β1)基因转染对异基因大鼠心脏移植物急性排斥反应的影响.方法 建立大鼠颈部心脏移植模型,转基因组供心切取后经冠状动脉缓慢灌注含携带TGF-β1基因腺病毒载体(每克心肌组织5×1010PFU)的Stanford大学液,再植入受体颈部.空载体组灌注腺病毒空载体(每克心肌组织5 × 1010PFU)的Stanford大学液,对照组灌注无病毒的Stanford大学液.结果 转基因组的移植物内外源性TGF-β1基因和蛋白表达,移植物内CD68表达减少,心肌细胞凋亡减少,移植物急性排斥反应的始发时间明显推迟,程度较轻.结论 经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导TGF-β1基因转移可明显减轻异基因大鼠心脏移植物急性排斥反应.     

急性白血病患者bcrp、mdr-1、mrp-1和lrp耐药基因表达的临床意义

目的：定量检测急性白血病(AL) 患者乳腺癌耐药相关蛋白基因（bcrp）、多药耐药基因（mdr-1）、多药耐药相关蛋白基因（mrp-1）及肺耐药相关蛋白基因（lrp）表达及其与临床的关系。方法：应用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应RT-PCR （real time fluorescent quantitative RT-PCR，FQ RT-PCR）检测105例AL 患者bcrp、mdr-1、mrp-1、lrp等基因的拷贝数,分析其与临床预后的关系。结果： AL组bcrp基因拷贝数（2.8×10³)±(8.4×10³）明显高于正常对照组（7.6×10²)±(2.3×10³）,P<0.05；mdr-1基因拷贝数（1.3×10⁵)±(2.2×10⁵）及lrp基因拷贝数（8.3×10⁵)±(1.0×10⁶）显著高于正常对照组（P<0.01）。复发组AL患者的mdr-1拷贝数（3.7×10⁴)±(1.1×10⁵）明显高于初治组患者（1.1×10⁴)±(3.6×10⁴）,P<0.05。在AL耐药组mdr-1拷贝数（2.1×10⁴)±(9.1×10⁴）明显高于敏感组（1.0×10⁴)±(3.8×10⁴）,P<0.05）。经直线相关分析显示mdr-1和mrp-1，mdr-1和lrp，mrp-1和lrp之间呈显著正相关，经等级相关分析显示mdr-1和lrp的表达与耐药性密切相关。结论：急性白血病多药耐药的出现与bcrp、mdr-1、mrp-1、lrp中一项或几项过度表达有关，mdr-1较其它基因更具有预测临床预后的意义。     

银染mRNA差异显示方法的建立

目的：建立银染mRNA差异显示方法，为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础，方法：采用随机引物和锚定引物各1条，建立差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT－PCR）和银染方法，对DDRT－PCR过程中各实验影响因素进行优化，割取差异条带进行二次扩增。结果：当总RNA用量为0．2ug，引物浓度为0．6－1．0umol/L,dNTP浓度为200unmol/L,MgCl2浓度为1．6－2.0mmol/L，时，同时起始5个循环的退火温度为50℃，扩增效率最佳，特异性好，背景 干净，结论：DDRT－PCR方法简便，灵敏，高效，可用于分离差异表达基因。     

实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β1 mRNA表达

利用荧光TaqMan技术 (5′核酸外切酶活性 )和一种可以实时检测荧光信号的仪器 (ABIPrism 770 0序列检测系统 ) ,在PCR反应完全封闭的情况下可实时检测PCR扩增的动力学变化 ,能够对标本扩增过程中的起始拷贝数快速、准确地定量 ,极大地克服了原有PCR技术存在的不足 ,已逐步成为PCR更新换代的新技术[1 ,2 ] 。目前常规检测 β1 转化生长因子(TGF β1 )表达多采用竞争RT PCR及内源性参比基因RT PCR ,它们都属于PCR终点法检测 ,很难对起始模板数准确定量。我们利用实时荧光定量RT PCR技术建立了检测TGF β1 mRNA表达的方法。…     

转染转化生长因子β1基因减轻非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应

目的探讨移植物局部转染转化生长因子β1(TGF-β1)基因对非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应(AVR)的影响。方法建立豚鼠到SD大鼠的颈部心脏移植模型,移植前受鼠接受中华眼镜蛇毒因子和环孢素A预处理,供心切取后,经冠状动脉按每克心肌组织灌注5×1010PFU携带TGF-β1基因的重组腺病毒载体进行基因转染,再移植到经过预处理的SD大鼠颈部(基因转染组),另设灌注5×1010PFU腺病毒空白载体的空白载体组和对照组。术后观察各组移植物的存活情况、移植物组织学变化情况以及移植物中CD68和CD57的表达、细胞凋亡指数、TGF-β1的表达。结果基因转染组移植物的存活时间为(95±3)h,明显长于空白载体对照组的(57±2)h和对照组的(60±2)h(P<0.01);各组移植物均呈急性血管性排斥反应的病理改变,但基因转染组较轻;基因转染组移植物组织中炎症细胞浸润数、CD68和CD57的表达量及细胞凋亡指数明显低于空白载体对照组和对照组,并能检测到外源性TGF-β1的表达。结论经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导的TGF-β1基因转移可减轻非协调性异种心脏移植AVR,明显延长移植物的存活时间。     

TGF-β1和/或TNF-α反义PS-ODNS对造血干/祖细胞体外扩增的作用

目的：研究TGF-β1和／或TNF—α反义硫代寡核苷酸(PS—ODNS)对造血干／祖细胞体外扩增的调节作用。方法：采用免疫磁珠分离技术从新鲜脐带血中分离CD34^ 细胞，用淋巴细胞分离液从骨髓血中分离单个核细胞，应用液体培养及造血祖细胞集落分析检测TGF-β1和／或TNF—α反义PS—ODNS对CD34^ 细胞数及多向性造血祖细胞(CFU—mix)、粒-单祖细胞(CFU—GM)、红系祖细胞(BHU—E和CFU—E)集落数的影响。结果：培养体系中加入TGF-β1反义PS—ODNS后CD34^ 细胞数、CFU—mix、CFU—GM、BFU—E和CFU—E集落数分别是对照组(仅加细胞因子组)的4、2．6、2．7、1．8、2．1倍；加入TNF—α反义PS—ODNS后CD34^ 细胞数、CFU—mix、CFU—GM、BHU—E和CFU—E集落数分别是对照组的4、2．9、2．6、1．7、1．8倍；同时加入TGF-β1和TNF—α反义PS—ODNS后CD34^ 细胞数、CFU—mix、CFU—GM、BHU—E和CFU—E集落数分别是对照组的5．3、2．1、2．7、1．9、1．8倍。结论：采用反义PS—ODNS阻断内源性TGF-β1和TNF—α是造血干／祖细胞体外扩增的有效措施之一。     

p53基因诱导白血病细胞凋亡的机制研究

目的：探讨p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中内源性TGF-β1、TNF-α、端粒酶活性、Bcl-2表达的改变及其意义。方法：利用脂质体将温敏型p53基因[pN53cG(Val135)]导入p53基因缺失的白血病细胞系HL-60、K562细胞，经G418筛选，获得稳定表达p53蛋白的抗性克隆细胞HL-60pN53cG，K562-pN53cG细胞。采用缺口末端标记法、片段化DNA分析、RT-PCR、定量PCR、ELISA、PCR-ELISA、流式细胞术等方法检测外源性p53基因诱导白血病细胞凋亡过程中TGF-β1、TNF-α、bcl-2、端粒酶反转录酶(hTERT)mRNA表达变化、细胞上清TGF-β1水平和端粒酶活性及。TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS对白血病细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的影响。结果:①外源性野生型p53基因诱导细胞凋亡过程中内源性。TGF-β1和TNF-α mRNA表达上调，bcl-2及hTERT mRNA表达下调，细胞培养上清TGF-β1蛋白水平明显升高，端粒酶活性水平下降；②TGF-β1、TNF-α反义PS-ODNS能够明显抑制野生型p53基因诱导细胞凋亡的发生，并使细胞bcl-2 mRNA及蛋白表达恢复到处理前的水平。结论：p53基因诱导白血病细胞凋亡可通过上调内源性TGF-β1和TNF-α水平，下调hTERT mRNA表达及端粒酶活性，抑制bcl-2基因表达而发挥作用。