肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠模型的表型研究

目的 探讨肝细胞特异性敲除HuR基因对小鼠肝脏功能的影响。方法 从美国Jackson实验室引进LoxP标记的人抗原R（human antigen R,HuR）基因小鼠（HuR^fl/fl）和Alb-Cre转基因小鼠。杂交后,经数代选育配种,建立肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠（HuR^LKO）模型。PCR技术鉴别小鼠基因型,蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检验小鼠肝脏的HuR表达水平,同时HE染色观察肝脏结构变化。高脂喂养HuR^fl/fl/Alb-Cre和HuR^fl/fl两组小鼠,观察小鼠体重、肝重和肝体比变化,提取血清检测肝脏损伤和脂肪代谢相关指标。结果 PCR成功检测筛选子代小鼠基因型,包括HuR^fl/fl/Alb-Cre和HuR^fl/fl小鼠。蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验证明小鼠肝细胞特异性HuR基因敲除成功。HE染色结果提示HuR^LKO小鼠的肝细胞出现变性水肿、局部坏死。高脂喂养实验提示两组小鼠在肝重、肝体比、AST、ALT、HDL-C、血糖上的差异具有统计学意义（P＜0.05）,但在体重、TG、LDL-C的差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论 HuR基因是维持小鼠肝细胞功能的必要基因,Cre-LoxP技术可成功构建HuR^LKO小鼠模型,且特异性高,表型明显,为研究HuR在肝脏各项疾病的发生发展中所扮演的角色,提供了一个很好的疾病模型。     

不同消毒液对胃肠道吻合口愈合的影响

目的探讨不同消毒液对胃肠道吻合口愈合的影响及影响程度,试图筛选出适合胃肠道吻合口的最佳消毒方法。方法对50只家兔实行胃-空肠、空肠-空肠单层缝合,随机分成5组,分别用不同消毒液消毒拟吻合组织黏膜;并在术后3、7 d取家兔腹水大肠埃希菌测定,在术后3、71、0 d留取吻合口标本检测吻合口破裂压、吻合口组织中胶原纤维含量测定。结果 5组死亡数差异无统计学意义;生理盐水组、乙醇组、聚维酮碘组、碘酊组和氯己定组腹水大肠埃希菌测定:术后3 d检测阳性率分别为50.0%、33.3%、11.1%、30.0%和22.2%,差异无统计学意义,术后7 d检测阳性率分别为80.0%、55.6%、22.2%、60.0%、88.9%,差异有统计学意义(P<0.01,χ2=34.55)。结论不同消毒液对胃肠道吻合口愈合的影响不同,聚维酮碘是胃肠道吻合口消毒最为理想的消毒液。     

大鼠糖原合成酶激酶-3β过表达基因慢病毒载体的构建与鉴定

糖原合成酶激酶-3β( Gsk-3β)是哺乳动物中广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶,它不但能磷酸化糖原合成酶,促进糖代谢,还可磷酸化一系列底物,包括代谢相关蛋白、信号转导蛋白、结构蛋白和一些转录因子,并参与PI-3K、Wnt及Hedgehog等信号通路,影响细胞的生存与凋亡、运动与迁移及肿瘤的生成等[1].我们通过构建大鼠Gsk-3β基因过表达慢病毒载体并实现该基因在WBF-344细胞中的稳定高表达.     

门静脉内注射葡聚糖微球建立门静脉高压症犬的血流动力学研究

目的 门静脉内反复注入葡聚糖微球建立犬门静脉高压症动物模型,结合ALC-BFS血流测定系统观察门静脉高压症犬血流动力学改变,并研究其发生机制.方法 16只犬建立门静脉插管后随机分成对照组(n=6)和实验组(n=10),实验组经导管向门静脉内注射葡聚糖微球,每5天1次,共6次,对照组同样方法注射生理盐水.实验过程中观察门静脉压力、血常规、肝功能、脾脏大小、肝脏病理变化;并行门静脉系统造影了解侧支循环的形成情况;应用ALC-BFS血流测定系统观察门静脉、脾静脉、肝动脉、脾动脉的血流动力学指标的变化.结果 实验组动物经门静脉注射葡聚糖微球后门静脉压力立即升高,术后4个月门静脉压力仍维持在(23.35±2.63)cmH2O,血常规、肝功能基本正常,组织学检查显示肝脏汇管区纤维化明显;门静脉系统造影可见门静脉末梢血管栓塞,侧支循环形成.与术前及对照组相比,术后4个月实验组犬的门静脉、脾静脉、肝动脉、脾动脉血管管径增宽;门静脉血流速度减慢,血流量轻微改变;脾静脉血流速度减慢,血流量增加;肝动脉、脾动脉血流速度增快,血流量增加.结论 经门静脉内注射葡聚糖微球栓塞门静脉末梢可以建立稳定的犬门静脉高压症模型;门静脉系统血流动力学测定显示血流速度减慢,肝动脉、脾动脉血流增加.     

大鼠GSK3β基因RNAi腺病毒载体的构建与鉴定及其对肝卵圆细胞增殖的促进作用

目的构建并鉴定特异性大鼠糖原合成酶激酶3β(GSK3β)基因siRNA腺病毒载体,观察其对肝卵圆细胞系WB-F344增殖的影响。方法用DNA重组技术将针对GSK3β基因不同部位所设计的2对shRNA序列克隆到高效RNAi真核表达质粒载体pGenesil-1.1中,构建shRNA表达载体pGenesil-1.1-GSK3β。分别酶切重组质粒及pDC312载体,转化连接,构建腺病毒载体pDC312-GSK3β,PCR扩增与鉴定。脂质体法介导腺病毒载体与骨架质粒pPE3-F11共转染293细胞,包装产生腺病毒颗粒AdD C3 12-GSK3β并测定滴度。取病毒上清感染WB-F34 4细胞,荧光显微镜观察细胞荧光含量,Western blotting检测GSK3β蛋白表达。CCK-8测定转染前后WBF-344增殖变化。结果经PCR酶切及Western blotting技术证实成功构建了针对大鼠GSK3β基因RNAi质粒pGenesil-1.1-GSK3β及GSK3β基因RNAi重组腺病毒载体AdDC312-GSK3β。Western blotting证实该重组腺病毒载体可抑制WBF-344细胞GSK3β的表达。CCK-8结果显示干扰GSK3β可促进WBF-344细胞增殖。结论成功构建了针对GSK3β基因RNAi的腺病毒载体,并在大鼠肝卵圆细胞系WBF-344中稳定表达,促进细胞增殖。     

miR-21在大鼠肝卵圆细胞活化和增殖过程中作用研究

目的 探讨miR-21调控肝卵圆细胞活化和增殖过程的可能机制.方法 采用2-乙酰氨基芴(2-AAF)/部分肝切除法诱导SD大鼠肝卵圆细胞活化模型,分别于0、6、12、24、72、168 h处死动物,同时以单纯肝切除的相应时间点作为对照,分别提取各标本RNA逆转录后行SYBR Green实时荧光定量PCR,检测各组miR-21的表达,行两样本t检验,并用生物信息学方法分析其调控的miRNA转录分子和靶基因.实时荧光定量PCR检测其靶基因表达,Westem blot法检测其靶基因蛋白表达,进行两样本均值的t检验,以P＜ 0.05为差异有统计学意义. 结果 成功建立大鼠肝卵圆细胞活化模型,检测miR-21的扩增信号,miR-21在实验组表达12h开始升高,24 h达到峰值,随后开始降低,168 h再次升高;而对照组6h开始升高,24h后开始下降后基本恢复原水平.实验组与对照组表达比较,实验组在6 h miR-21的表达低于对照组,t=3.029,P=0.039,差异有统计学意义;而在24 h和168 h的表达高于对照组,t值分别为-3.433、-5.105,P值均＜0.05,差异有统计学意义.根据三个数据库的综合评分,结合相关文献,我们选取Smad7为研究的靶基因.检测两组Smad7mRNA表达,对照组中在6h略有下降,后开始升高,在24 h达到峰值后开始下降恢复原水平;在实验组中,6h升高后至24 h达到峰值,随后开始降低,168 h又略有升高.对照组Smad7蛋白表达从6h开始降低,到24 h达到最低后开始升高;实验组6h升高,随后下降,168 h达到最低.Smad7 mRNA表达量变化趋势与miR-21表达变化趋势基本一致,Smad7蛋白表达和miR-21表达变化趋势呈负相关. 结论 成功建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测大鼠miR-21的方法,证实miR-21在肝卵圆细胞活化与增殖中起重要作用,Smad7作为miR-21的靶基因可能参与这一过程.     

肝细胞癌中氨基肽酶N(CD13)的表达及其临床意义

目的 探讨氨基肽酶N(CD13)在肝细胞癌中的表达水平及其临床意义.方法 应用免疫组织化学染色方法检测CD13在55例肝癌组织及其相应癌旁组织和13例正常肝组织中的表达水平.运用X2检验分析肿瘤组织中CD13表达与临床病理因素的关系.运用Kaplan-Meier法分析肿瘤组织CD13与患者术后总生存时间的关系.结果 CD13在肝癌组织中的阳性表达率为72.73％(40/55),在癌旁组织的阳性表达率为21.81％(12/55),在正常肝组织的阳性表达率为7.69％(1/13).与癌旁组织和正常组织比较,肝癌组织中CDI3的阳性表达率显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05).进一步分析显示CD13表达与肝癌的分化程度、包膜侵犯、淋巴结转移、门静脉癌栓形成、临床TNM分期等临床病理因素相关(P＜0.05).K-M生存曲线提示肿瘤CD13阳性表达的病例较阴性表达者生存率降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).多因素COX逐步回归分析提示CDI3是影响总体生存率预后的独立危险因素.结论 CD13在肝癌的发生和发展中可能发挥重要的作用,可作为肝癌临床诊断和判断预后的一项重要指标.