离体成纤维细胞热损伤模型制作的研究

目的 建立离体细胞烫伤诱导凋亡的模型，深入研究组织烫伤后主要修复细胞成纤维细胞的变化。方法 利用体外细胞培养技术对含小牛血清（体积分数为５％和10％）的DMEM培养液中的成纤维细胞进行不同温度（43，45，48℃）和不同时间（10,30,40min）的处理，对照组细胞置于37℃水浴30min。采用DNA凝胶电泳、Hoeschst33258荧光染色、逶射电镜等技术对烫伤细胞进行检测并分析结果。结果 在水浴中，成纤维细胞育10，30，40min均可出现细胞凋亡，以含体积分数为5％小牛血清的DMEM培养液、45℃水浴10min一组最为明显。48℃中水浴30min以上，则出现大量的细胞坏死。对照组中无明显的细胞凋亡发生。结论 热损伤能造成离体成纤维细胞发生凋亡。该方法有助于在离体情况下探讨创伤修得过程中成纤维细胞生物学特性。     

丝裂原活化蛋白激酶通路对成纤维细胞内游离钙的影响

为观察碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)对离体热烫伤后成纤维细胞内钙离子的作用以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通过对胞内游离钙的影响，将培养的人成纤维细胞进行热损伤刺激后分成4组：（1）bFGF处理组（10ng/ml);(2)预先加ＰＤ９８０５９（10μmol/L)阻断剂３０min，再行bFGF(10ng/ml)刺激；（３）预先加入ＳＢ２０３５８０（１０μmol/L)阻断剂30min，再行bFGF刺激（10ng/ml)；（4）同时加入PD98059（10μmol/l)和SB203580（10μmol/L)2种阻断剂30min，再加入bFGF(10ng/ml)，应用特异性Ca^2 荧光指示剂Fluo-3/AM负载细胞，激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙的浓度，结果：显示，受热刺激的成纤维细胞荧光强度较弱，加入bFGF后可促使成纤维细胞中游离Ca^2 浓度升高，分别预先加入PD98059和SB203580损坏抗剂的成纤维细胞，再加入bFGF，胞内钙离子浓度出现不同的钙振荡现象，同时加入2种阻断剂后胞内钙离子浓度则迅速降低，表明bFGF引起热损伤后的成纤维细胞中游离Ca^2 浓度的增加，MAPK信号通路对胞内钙离子有反馈调节的作用。     

热损伤诱导的丝裂原活化蛋白激酶对活化蛋白-1的影响及其意义

目的 观察成纤维细胞热烫伤后丝裂原活化蛋白激酶以及活化蛋白-1的表达。方法 将培养的人成纤维细胞分成4组：(1)单纯热损伤刺激组；(2)热损伤刺激 碱性成纤维细胞生长因子处理组(10μg／L)；(3)预先加入PD98059(10μmoL/L)，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激；(4)预先加入PD98059 SB203580(各10μmol／L)阻断剂30min，再行热损伤 碱性成纤维细胞生长因子刺激。伤后0、30、60和180min检测细胞外信号调节激酶(ERK)和原癌基因c-fos蛋白。结果单纯热刺激的成纤维细胞ERK表达增加，随后消失。碱性成纤维细胞生长因子刺激ERK表达增加显著，时间延长。加入PD98059拮抗剂，ERK的表达受抑制。原癌基因c-fos的表达开始增加，随后减弱。同时阻断ERK和p38MAPK两条通路，c-fos弱阳性表达。结论 碱性成纤维细胞生长因子引起热损伤成纤维细胞ERK表达增加，原癌基因c-fos是MAPK信号通路下游重要的靶蛋白。     

成纤维细胞生长因子2对凋亡成纤维细胞中S100蛋白表达的影响

目的观察热损伤后成纤维细胞凋亡模型中,外用成纤维细胞生长因子2(FGF2)对凋亡细胞S100蛋白表达的影响。方法用含体积分数5％小牛血清的DMEM溶液培养已大致融合的成纤维细胞24 h,置入45℃恒温水浴锅中孵育10 min,建立热损伤细胞模型(热损伤组,3瓶),在上述基础上立即加入FGF2(FGF2组,10μg/L,3瓶)。两组细胞继续常规培养30 min后作免疫荧光双标记,利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)和增殖细胞核抗原(PCNA)以及S100蛋白、磷酸酪氨酸蛋白(P-tyr)、src基因产物蛋白同源的酪氨酸激酶催化功能区-2(SH2-P)表达的变化。结果热损伤组细胞可以同时表达caspase-3蛋白和PCNA两种抗体, 其灰度值分别为140±31、52±8;FGF2组细胞亦见上述两种抗体表达,灰度值分别为75±28、131± 17,PCNA表达量与热损伤组比较,差异有统计学意义(P<0．05)。同时,热损伤组成纤维细胞S100、 P-tyr蛋白、SH2-P蛋白表达阳性,FGF2组细胞S100蛋白和SH2-P的表达明显较弱(P<0．05)、P-tyr 的表达略有减弱。结论离体情况下,热损伤可诱导成纤维细胞凋亡信号的表达;S100蛋白在 FGF2对热损伤导致的凋亡成纤维细胞的增殖和抗凋亡作用中扮演重要角色。     

离体热损伤成纤维细胞所涉及的细胞信号通路

利用已建立的成纤维细胞热损伤诱导凋亡模型观察离体培养的成纤维细胞热烫伤后信号通路的活化情况。首先将原代培养的人成纤维细胞经5～6传代后，45℃水中孵育10min，造成单纯热损伤刺激，加入5％小牛血清继续培养，分别在伤后0、30、60和180min 4个时相点冻存细胞，运用Western blot进行MAPKs信号通路磷酸化蛋白印迹检测，同时采用荧光显微镜检测热损伤成纤维细胞caspase3蛋白的表达情况。结果显示，经过热损伤刺激的成纤维细胞，c-jun N末端激酶(JNK)首先开始表达，并在60min达到高峰，能持续至180min。细胞外信号调节激酶(ERK)的表达高峰在伤后30min，随后迅速消退。损伤早期，成纤维细胞内caspase3阳性标记的细胞数较少，至伤后60min，caspase3的表达明显增强。研究表明，ERK和JNK信号通路在热损伤诱导成纤维细胞生物学特性变化过程中具有重要意义。