异硫氰酸荧光素标记动态观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞的损伤

目的:应用异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白,在激光共聚焦显微镜下直接观察天花粉蛋白进入黑色素瘤B16细胞的动态过程并分析其对黑色瘤B16细胞的损伤作用。方法:实验于2003-08/2004-08在南通大学神经再生重点实验室完成。将常规传代培养的黑色素瘤B16细胞用胰酶消化,以5×109个/L的浓度种植于24孔培养板。将天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白分别加入培养细胞中,终浓度为50mg/L,同时加入等量生理盐水作为正常对照组,每组再分别设3,6,12h不同孵育时间组。异硫氰酸荧光素标记天花粉蛋白后,利用激光共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白进入细胞的过程及其荧光强度,CCK-8细胞毒性实验评估各组细胞存活率、并用单细胞凝胶电泳及hoechst33258染核观察天花粉蛋白对黑色素瘤B16细胞致DNA损伤作用。结果:①终浓度50mg/L的异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白孵育3h时已经进入黑色素瘤细胞,6h时进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,各时间点比较差异有统计学意义(P<0.01)。异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白组与异硫氰酸荧光素-牛血清白蛋白组荧光强度差异有显著性(P<0.01)。②终浓度50mg/L异硫氰酸荧光素-天花粉蛋白、天花粉蛋白孵育黑色素瘤细胞3,6h后利用单细胞电泳和Hoechst33258染色未观察到核形态的变化;但孵育6h后CCK-8细胞毒性实验显示活细胞数量明显下降;孵育12h后出现DNA损伤的特征性彗星尾现象,并观察到明显的核浓缩和边集现象,出现特征性凋亡小体。结论:孵育6h时天花粉蛋白进入细胞量最多,但并没有明显的细胞DNA损伤的作用,而孵育12h时产生明显的细胞毒作用和凋亡的发生。     

HSPgp96诱导巨噬细胞呼吸爆发与细胞内外游离钙关系的研究

目的：探讨从小鼠H₂₂肝癌细胞中提纯的热休克蛋白gp96（HSPgp96）对小鼠腹腔巨噬细胞（PEMφ）呼吸爆发的影响及其与细胞内外游离钙的关系。方法：(1)用亲和层析和离子交换层析等方法从小鼠H₂₂肝癌细胞中获得纯化的HSPgp96。(2)用细胞内过氧化物荧光探针H₂DCF-DA监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中，单个细胞活性氧（ROS）信号的变化,反映PEMφ内呼吸爆发时的变化过程；用荧光探针Fluo-3/AM监测HSPgp96作用于小鼠PEMφ过程中，单个细胞内钙离子（［Ca2+］_i）信号的变化。(3)使用细胞膜和细胞内钙通道抑制剂及钙离子载体后，再观察HSPgp96作用后ROS信号的变化。结果：(1)加入HSPgp96后PEMφ内Fluo-3荧光强度立即上升，70s时增幅达161.05%±50.99%；当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后110s增幅分别为84.81%±29.52%和46.21%±17.24%。同时阻断胞内外钙作用，HSPgp96这一诱发功能明显被抑制。加入钙离子载体后可见细胞内荧光强度迅速增强，于110 s时达156.98%±45.83%，随后迅速下降。(2)小鼠PEMφ受HSPgp96刺激后表征ROS的荧光强度立即上升，620 s达基础荧光值的636.78%±82.02%，随后始终维持在高水平。当分别阻断细胞外钙内流、抑制细胞内钙库释放功能后，再加入HSPgp96后细胞内ROS荧光值上升幅度较小。同时阻断了胞内外钙作用后，HSPgp96刺激后ROS荧光值上升没有明显高峰出现。结论：HSPgp96作用于小鼠PEMφ后，促进了细胞外钙内流并使细胞内钙库释钙，这是HSPgp96诱发细胞内活性氧增加的基本机制。     

COPD患者照顾者姑息照护接受度及影响因素分析

目的 调查慢性阻塞性肺疾病患者照顾者姑息照护接受度及影响因素,为实施针对性护理干预提供参考.方法 采用一般资料调查表、慢性病患者照顾者姑息照护接受度量表,对125名慢性阻塞性肺疾病患者照顾者进行调查.结果 患者照顾者姑息照护接受度总分65.98±11.03;不同文化程度、能否胜任照顾者角色、不同子女数、与家人关系是否融洽的照顾者姑息照护接受度得分比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).结论 慢性阻塞性肺疾病患者照顾者对姑息照护接受度较高,有益于我国姑息照护服务的开展;仍需加强低文化程度、不能胜任照顾者角色、子女数目较多、与家人关系不够融洽的照顾者知识宣教,改善其身心状况,优化患者及照顾者的生活质量.     

心肌细胞生长激素信号传导与MAPK超家族

生长激素刺激培养生大鼠心肌细胞，用含ＭＢＰ凝胶分离法测定细胞信号调节酶活性。生长激素诱导的心肌细胞ＥＲＫ激活，可能是生长激素心脏效应的重要机制之一。     

《生物医学电子显微镜技术》课程教学初探

《生物医学电子显微镜技术》主要是在很多医学等高等学校中,特别是在研究生教育中开设的的一门多学科交叉课程。该门课程对于培养高素质的生物医学类人才具有重要意义。为提高学生的学习兴趣,努力取得较好的教学效果,本文结合日常的课堂及实验课教学实践,探索适应现阶段实际情况的本课程教学方法。     

激光共聚焦镜下观察天花粉蛋白进入瘤细胞的动态过程

目的:观察FITC标记的天花粉蛋白(TCS)进入瘤细胞的过程。方法:通过低温离心、丙酮分级沉淀、等电点沉淀及透析技术由新鲜栝楼根原汁中提取TCS;用FITC标记TCS,在激光共聚焦显微镜下动态观察FITC-TCS进入瘤细胞的过程。结果:纯化的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析为单一带,且与标准TCS泳率相同;终浓度50μg/ml FITC-TCS的孵育3h时已经进入黑色素瘤B-16细胞,6h时FITC-TCS进入细胞量达到最高,12h时已轻度下降,组间差异有统计学意义(P<0.01)。FITC-TCS组与对照组(FITC-BSA)荧光强度差异有统计学意义(P<0.01)。结论:采用FITC-TCS,可在激光共聚焦显微镜下观察到进入瘤细胞的动态过程。     

热休克蛋白gp96-肽复合物的提取及纯化

目的：建立从比肝癌细胞中提取、纯化热休克蛋白gp96-肽复合物的方法。方法：①制备H22肝癌细胞蛋白：将H22盘肝癌细胞裂解、离心、过滤及透析后获得。②gp96-肽复合物的纯化：上述可溶性H22肝癌细胞蛋白经分级硫酸铵盐析后，依次用ConA-Sepharose亲和层析、Sephadex G25更换缓冲液及DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化。③gp96-肽复合物的鉴定和浓度测定：所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定，Lowry法测定蛋白浓度。结果：分离、纯化得到的蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染鉴定为单一带，分子量为96kD；Western blot结果证实为HSP gp96。每20ml压积H22细胞最终获得1mg的HSP gp6。结论：使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP gp96肽复合物。     

天花粉蛋白诱导H22肝癌细胞凋亡的研究

目的观察天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)在体外诱导H22肝癌细胞凋亡的效果.方法以不同剂量的TCS加入到H22肝癌细胞溶液中,在24孔培养板上培养72h后荧光染色并涂片,激光共聚焦显微镜下观察TCS诱导H22肝癌细胞凋亡的作用效果.结果10μg/ml浓度的TCS就可诱导H22肝癌细胞出现典型的凋亡形态学特征.经统计学分析,100μg/mlTCS组与50μg/mlTCS组间差异无统计学意义(P>0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P<0.01).TCS的作用浓度与凋亡指数间有正相关关系(r=0.9713,P<0.01).结论TCS在体外可诱导H22肝癌细胞发生凋亡,诱导H22肝癌细胞凋亡是TCS抗肝癌作用的机制之一,具有成为肝癌治疗新药的潜在价值.     

骨髓基质细胞对背根神经节细胞生长的影响

目的:体外研究骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells,MSCs)对背根神经节细胞生长的影响。方法:采用差速贴壁的方法分离、培养大鼠骨髓基质细胞。经transwell膜与新生大鼠背根神经节细胞联合培养。利用MTT、细胞免疫荧光组织化学方法检测骨髓基质细胞对背根神经节细胞生长的影响。结果:联合培养后的新生大鼠背根神经节细胞活力增加,神经突起增长。结论:骨髓基质细胞对于背根神经节细胞的活力以及神经突起生长有一定的促进作用。     

HSPgp96与rIL-2治疗小鼠H22肝癌移植瘤的实验研究

目的：研究热休克蛋白gp96(Heat—Shock Protein gp96，HSPgp96)—肽复合物瘤苗与重组人白介素-2(Recombinant Human Interleukin-2，rIL-2)对小鼠H22肝癌移植瘤的治疗效果。方法：从H22肝癌细胞中提取和纯化HSPgp96。建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，应用HSPgp96与rIL-2治疗并比较疗效，观察指标：瘤重，光镜、电镜下观察组织结构。结果：经鉴定获得纯化的HSPgp96。HSPgp96 5μg与rIL-2 25ku治疗小鼠H22肝癌有效。结论；该实验方法提纯的HSPgp96与重组人IL-2都能有效抑制小鼠H22肝癌移植瘤的生长。