白藜芦醇通过Wnt/β-catenin信号通路调控髓核细胞细胞外基质表达

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对退变髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)表达的调控作用及其相关分子机制。方法选取临床上接受椎间盘摘除术的10例患者,其中5例为年轻脊柱爆裂骨折患者,作为对照组;余5例为老年腰椎间盘突出症患者,作为退变组。取两组患者髓核组织,免疫组织化学染色比较β-catenin的原位表达,Western blot检测β-catenin、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(Aggrecan)蛋白表达。取退变组髓核组织分离、培养NPC,分别用IL-1β单独(B组)或联合RES(C组)刺激第3代NPC,并设未刺激细胞作为空白对照组(A组),Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。进一步采用小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)靶向沉默SIRT1和β-catenin后,采用Western blot、实时荧光定量PCR检测β-catenin、SIRT1蛋白和基因表达。用完全培养基(1组)、IL-1β(2组)、RES+IL-1β(3组)、SIRT1-si RNA+RES+IL-1β(4组)刺激第3代NPC培养24 h后,细胞免疫荧光染色检测β-catenin核转位情况;用完全培养基(Ⅰ组)、IL-1β(Ⅱ组)、IL-1β+β-catenin-si RNA(Ⅲ组)、IL-1β+RES(Ⅳ组)、IL-1β+RES+SIRT1-si RNA(Ⅴ组)刺激第3代NPC培养24 h后,采用Western blot检测Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达。结果免疫组织化学染色及Western blot检测示,与对照组比较,退变组髓核组织中β-catenin阳性表达的细胞比例显著升高(t=4.616,P=0.010);β-catenin蛋白相对表达量显著升高,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白相对表达量显著下降(P0.05)。细胞学实验发现,B组β-catenin蛋白相对表达量显著高于A、C组,Ⅱ型胶原和Aggrecan相对表达量显著低于A、C组(P0.05)。si RNA转染后,Western blot检测显示SIRT1、β-catenin蛋白表达显著降低(P0.05)。细胞免疫荧光染色结果进一步提示与3组相比,4组SIRT1被si RNA沉默后,RES减弱的β-catenin核转位现象加剧。Western blot检测示,Ⅱ组Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅰ组明显降低(P0.05);Ⅲ组NPC转染β-catenin-si RNA后,IL-1β对ECM的降解作用被明显抑制,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅱ组明显升高(P0.05);Ⅴ组NPC转染SIRT1-si RNA后,抑制了RES对ECM降解的保护作用,Ⅱ型胶原和Aggrecan蛋白表达较Ⅳ组明显降低(P0.05)。结论 RES可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路维持NPC ECM的表达,为椎间盘退行性疾病的治疗提供了新思路。     

白血病抑制因子对退变髓核细胞胞外基质的影响

目的：探讨退变椎间盘髓核组织白血病抑制因子（leukemia inhibit factor,LIF）表达及其对胞外基质表达的影响。方法：40只新西兰兔随机分5组（1组为对照组,4组为实验组）,每组8只。针刺法建立L4/5、L5/6椎间盘退变模型,术后0、2、4、8周对椎间盘进行MRI扫描及HE染色评价退变程度,免疫组化检测髓核组织LIF的表达。体外原代培养兔髓核细胞,不同浓度重组LIF蛋白刺激髓核细胞24、48、72 h,Western blot检测聚蛋白多糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原（COLLA2α1）的表达,免疫荧光检测最大浓度组和对照组Aggrecan的表达并行Western blot检测金属蛋白酶组织抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP-1）和基质金属蛋白酶-3（matrixmetalloproteinase-3,MMP-3）的表达。结果：影像学和组织学评分显示椎间盘退变随造模时间延长而加重,各组间差异有统计学意义（1.000±0.000,2.000±0.535,2.750±0.463,3.875±0.354,P=0.000;4.000±0.000,7.375±0.518,9.375±1.302,11.750±0.463,P=0.000）。免疫组化显示2周组LIF表达最高,随着椎间盘退变加重,其表达降低,但各组均高于0周组,差异有统计学意义（559.608±68.689,16 135.613±577.329,8 149.739±457.189,2 018.254±211.870,P=0.000）。细胞学实验显示,加入不同浓度LIF刺激后,Aggrecan、COLLA2α1的蛋白表达与LIF刺激浓度呈正相关,各处理组与对照组差异有统计学意义（0.191±0.020,0.212±0.020,0.321±0.041,0.511±0.032,0.561±0.042,P=0.000）,Aggrecan免疫荧光结果与之相符。处理组TIMP-1表达明显高于对照组（0.454±0.022,0.211±0.012,P=0.000）,MMP-3明显低于对照组（0.243±0.013,0.362±0.021,P=0.000）。结论：LIF在退变髓核组织中表达上升,且具有促进胞外基质合成作用,其潜在机制与LIF能够上调TIMP-1并下调MMP-3作用相关。分为A组（AMD3100+NS动员组）,B组（AMD3100+G-CSF动员组）,C组（G-CSF+AMD3100动员组）和D组（NS空白对照组）;80只db/+小鼠为相应对照组,分组对应为A’组,B’组,C’组和D’组。每组在动员后第3 、7、10、14 天4个时间点于心脏部位取外周血,流式细胞仪检测CD34+/CD133+/Flk-1+细胞的比例。结果取平均值用均值±标准差（单位%）表示,统计学方法处理后进行比较和分析。结果：①D组和D’组在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例无差异（P >0.05）,但D’组中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例高于D组（P=0.003）。②A组、B组和C组db/db小鼠在动员后第3、7、10、14 天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,A组至第7 天达到峰值,随后逐渐下降;B组和C组至第10 天达到峰值,随后逐渐下降,且在达到峰值时CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在第10 天,B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A组和D组高（P=0.000）,但B组和C组db/db小鼠外周血中CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例之间的差异无统计学意义（P >0.05）。③A’组、B’组和C’组db/+小鼠在动员后第3、7、10、14天4个时间点,CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例逐渐上升,至第7 天达到高峰,随后逐渐下降,且在第7天CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例与其余3个时间点相比差异有意义（P=0.000）。在达到峰值的第7天,C’组CD34+/CD133+/Flk-1+细胞比例较A’组、B’组和D’组高（P=0.000）。结论：AMD3100联合G-CSF动员骨髓EPCs的效果优于单一使用AMD3100的动员效果,在非糖尿病状态下,先使用G-CSF再联合AMD3100的动员作用更优,但在糖尿病状态下先使用AMD3100再联合G-CSF的动员作用更优。