人TIMP-2重组腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建含人TI MP-2(hTI MP-2)基因的重组腺病毒载体并在大鼠主动脉平滑肌细胞中表达,为血管疾病基因治疗提供实验基础。方法:利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1以及线性化的重组穿梭质粒pTrack-CMV-hTI MP-2共转化BJ5183受体菌,并在其中发生同源重组,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子;重组腺病毒质粒AdhTI MP-2经过293细胞的包装,扩增和纯化后,测定病毒滴度。腺病毒体外感染大鼠主动脉平滑肌细胞,一步法提取细胞总RNA,RT-PCR检测hTI MP-2的mRNA。并收集细胞上清,进行Western blot检测TI MP-2蛋白。结果:得到了携带hTI MP-2基因的重组腺病毒,纯化后滴度为4×1011efu/ml,在感染VSMC后24h即检测到hTI MP-2的表达。结论:成功地构建了携带hTI MP-2的重组腺病毒载体并体外转染VSMC,为下一步应用于血管疾病基因治疗提供了基础。