少加样高收效制备创伤修复剂纤维粘连蛋白的方法

背景：纤维粘连蛋白不仅对细胞起支架作用，而且是细胞间重要的连结因子。具有类似调理素作用，可促进单核吞噬细胞系的吞噬功能，在炎症和创伤中起修复作用。目的：以新鲜健康男性“O”型血浆为原料，为制备纤维蛋白结合素筛选出加样量小，方法简便、收得率高的纯化方法。设计：开放性实验。单位：广州市红十字会医院暨南大学第四附属医院创伤外科研究所。材料：实验于2000-07／2002-07在广州市红十字会医院创伤外科研究所完成。材料主要包括新鲜健康男性“O”型血浆、明胶、CNBr-acdvated Sepharose 4B、交联葡聚糖G-25、尿素、三羟甲基氨基甲烷等。方法：用明胶与溴化氰活化琼脂糖珠偶联的亲和层析柱对纤维蛋白结合素进行纯化。①加入血浆：取新鲜健康男性O型血浆150mL，每次向柱内加入25mL，停留20min，流速3．5mL／min。②去杂蛋白：用pH7．5的Tris-柠檬酸钠平衡液洗柱，洗至流出液280nm下吸光度值〈0．02，再用含1mol／L NaCl的Tfis-柠檬酸钠洗去其他杂蛋白。③收集纤维蛋白结合素：用3mol／L脲-Tfis洗脱液洗柱。收集纤维蛋白结合素。④纤维蛋白结合素收集液去尿素：取纤维蛋白结合素的收集液，过Sephade G-25，去除尿素。⑤除菌：用0．22μm滤菌器过滤除菌。主要观察指标：①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响。③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响。结果：①十二烷基黄酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为3％，纤维蛋白结合素电泳结果为单一蛋白区带。②停留时间对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响：血浆加样量为150mL，柱内不停留和停留时间为10，20，30min时纤维蛋白结合索收得率分别是（65．24&;#177;3．45）％，（74．77&;#177;4．05）％，（86．99&;#177;4．10）％，（80.47&;#177;3．75）％。③加入血浆量对提纯纤维蛋白结合素收得率的影响：柱内停留时间为20min时。血浆加样量为100，130，150，180mL时纤维蛋白结合素收得率分别是（72．56&;#177;3．63）％，（77.61&;#177;3．14）％，（86．99&;#177;12）％，（74．67&;#177;3．05）％。结论：在明胶亲和柱体积不变的条件下，制备纤维蛋白结合素的量与血浆加样量、血浆在柱内停留时间密切相关。明胶亲和柱的血浆最佳加样量为150mL，每次血浆在柱内停留时间应为20曲，此法制备的纤维蛋白结合素加样量小，收得率高。     

降低木瓜蛋白酶灰分的探讨

用乙醇法从木瓜乳汁中提取高质量木瓜质量蛋白酶，乙醇在木瓜乳液中的提取浓度以６０％为最佳。制备出木瓜蛋白酶其酶活力达到１３０万国际单位，灰分低于１２％，符合药用标准。     

香菇多糖提取方法探讨

报道了香菇子实体，筛选出较为理想的香菇多糖提取方法：香菇子实体加蒸馏水在90℃－100℃加热回流，提取，用氯仿-正丁醇去蛋白，经水流动透析，用72％乙醇沉淀多糖，得水提香菇多糖。收得率为3．32％。其子实体残渣用1mol／LNaOH提取，充氮防氧化，调pH至中性，经透析，沉淀为碱提非水溶性多糖，收得率为0．36％。上清液为碱提水溶性多糖，收得率1．94％。     

纤维连结蛋白半定量测定的研究

通过建立用单向免疫扩散法测定纤维连结蛋白（ＦＮ）半定量的方法；建立广州地区男性和女性ＦＮ正常值的标准及建立简单可行，适合于基层检测ＦＮ的方法；通过筛选出最佳抗ＦＮ血清的浓度，建立不同浓度ＦＮ抗原的标准曲线；采集广州地区５０例男性，５０例女性健康成年人血浆，用单向免疫扩散法测定春ＦＮ含量。结果显示，广州地区健康成年男性，女性的ＦＮ正常值与其它地区文献报道的结果大致相同。     

建立ELISA法检测烧伤患者血清纤维连接蛋白活性

目的 :建立ELISA法检测烧伤患者血清纤维连接蛋白 (Fn)结合明胶活性并阐明其意义。方法 :采用明胶包被ELISA法 ,包被、封闭、加入待检血清、抗人Fn抗体、HRP SPA及TMB显色 ,测定 345例烧伤患者及 37例健康人血清Fn活性。结果 :该ELISA法敏感度高、特异性强、重复性好。检测烧伤患者血清发现Fn活性随着烧伤面积和深度的增加而降低 ,特重度烧伤患者Fn活性较健康人显著降低 (P <0 0 5 ) ,烧伤合并感染者血清Fn活性较未感染者降低。结论 :患者血清Fn活性下降与烧伤面积、深度和机体感染有关。测定Fn活性的ELISA方法学确立为阐明血清活性Fn在疾病中免疫生物学意义提供实验手段     

间歇低氧对大鼠肝脏GSK-3及mTOR表达的影响

目的 测定间歇低氧大鼠肝脏糖原合成酶激酶-3(GSK-3)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达,观察间歇低氧对胰岛素信号转导通路的影响.方法 将24只健康雄性Sprague-Dawley大鼠按照随机数字表法分成间歇空气组(NC组)、间歇低氧4周组(IH4组)、间歇低氧8周组(IH8组),每组8只.于上午9:00至下午5:00将IH4组及IH8组暴露于间歇低氧舱内,NC组则给予间歇压缩空气.检测各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素(FINS),并以稳态模型评估-胰岛素敏感指数(HOMA-IS)及稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评价胰岛素抵抗;免疫组化法测定大鼠肝脏GSK-3及mTOR的表达,以平均灰度值评价二者的蛋白表达量.结果 与NC组相比,IH4组、IH8组HOMA-IS降低,空腹血糖、FINS、HOMA-IR升高,以IH8组更为显著(F值分别为62.52,100.37,68.90,8549,P均＜0.01);与NC组相比,IH4组、IH8组GSK-3及mTOR蛋白表达均升高,以IH8组更明显(F值分别为72.25,148.01,P均＜0.01).Pearson相关分析显示GSK-3、mTOR平均灰度值与HOMA-IS呈正相关(r =0.786,0.811,P均＜0.01),与HOMA-IR呈负相关(r=-0.882,-0.889,P均＜0.01).结论 间歇低氧暴露使大鼠肝脏GSK-3、mTOR表达增加,从而引起胰岛素抵抗.     

成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及复合因子对兔ACL、MCL体外增殖作用

目的观察酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)以及复合因子对兔前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)和内侧副韧带(medial collateral ligament，MCL)的促增殖作用。方法分离传代培养10周龄新西兰大白兔骨关节韧带的ACL和MCL的成纤维细胞，接种96孔板，并加入浓度为0(对照组)、1、5、10、50、100ng／ml的aFGF或bFGF，浓度为0(对照组)、1．56、3．13、6．25、12．50、25、50ng／ml的EGF，单独或aFGF EGF两种因子联用与细胞(n=4)共同培养48h，以XTT方法测定其促细胞增殖作用。结果3种生长因子单独应用对ACL和MCL都有促进作用，aFGF对两种细胞均存在量效关系；bFGF 1ng／ml，EGF 5ng／ml对ACL作用最好，而对MCL则是bFGF和EGF均存在量效关系。浓度为5ng／ml的aFGF与50ng／ml的EGF联合1ng／ml aFGF与3．13ng／mlEGF作用于ACL或MCL均有协同作用。结论3种生长因子对ACL和MCL均有促进作用，单独应用aFGF或联用EGF优于单一因子促进兔ACL和MCL细胞的增殖，并且提示低浓度的aFGF联用EGF优于单一生长因子。