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1.
目的 构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化.以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株,用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果 所构建的人ARPC2的His融合蛋白表达载体是正确的,该载体可在大肠杆菌内高效表达,用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36000的融合蛋白。结论 成功构建了人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中获得了高效表达和纯化,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。 相似文献
2.
背景:肌动蛋白和Tau蛋白分别是微丝和微管的重要组成成分,肌动蛋白和Tau蛋白的分布能否作为微丝和微管的观察指标。
目的:构建肌动蛋白和Tau蛋白的红色和绿色荧光蛋白融合表达载体并转染真核细胞,观察其在细胞内的表达和定位情况。
设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2008-03/08在南方医科大学病理生理学教研室和广东省蛋白质组学重点实验室共同完成。
材料:克隆在pcDNA3载体上的肌动蛋白和Tau蛋白真核表达载体pcDNA3-actin和pcDNA3-Tau,以及红色荧光蛋白表达载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2、大肠杆菌株DH5α和小鼠NIH3T3细胞系由南方医科大学病理生理学教研室保存。
方法:将克隆在pcDNA3上的肌动蛋白和Tau蛋白亚克隆到红色荧光蛋白载体pmCherry-C2和绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,然后转染NIH3T3细胞,利用荧光显微镜观察重组载体的表达和细胞内定位。
主要观察指标:NIH3T3细胞转染24 h后,利用Leica荧光显微镜观察上述重组载体在细胞中的表达和定位情况。
结果:重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在NIH3T3细胞中可获得高量表达。融合蛋白发出的红色和绿色荧光均表明,肌动蛋白在细胞质中呈短丝状弥散分布,Tau蛋白以细胞核为中心呈放射状排列。
结论:成功构建了肌动蛋白和Tau蛋白的不同荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中得到有效表达,这为研究细胞骨架在信号分子移位中的作用提供了一个重要的工具。 相似文献
3.
目的:构建绿色荧光蛋白一串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体(His-EGFP-3xNLs),并在原核细胞中进行表达与纯化.方法:采用PCR方法从原先克隆在pEGFP-C1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来,使用常规酶切和连接方法将其重组至pET-14b载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.转化BL21(DE3)大肠杆菌株,用IPTG诱导融合蛋白表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白.结果:构建的His-EGFP-3xNLs融合蛋白表达载体是正确的,该载体可在大肠杆菌内高效表达,用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36kD的融合蛋白.结论:成功构建了His-EGFP-3xNLS融合蛋白表达载体,并在原核细胞中获得了高效表达和纯化,为进一步研究NLS介导信号分子人核提供了实验材料. 相似文献
4.
目的: 观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法: 采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pcDNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeLa细胞系沉默Prdx4的表达;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平的变化;应用划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果: pcDNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组HeLa细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而Prdx4 shRNA HeLa稳定干扰细胞系Prdx4表达水平明显下调(P<0.05)。Prdx4过表达组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显增强,与空白对照组及空载体转染组比较,差异显著(P<0.01)。Prdx4表达干扰组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论: 上调Prdx4蛋白表达水平可促进HeLa细胞的迁移和侵袭,在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用;下调Prdx4蛋白表达水平可以明显抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。 相似文献
5.
晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具. 相似文献
6.
病理生理学教学改革探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
将最新科研成果及时充实到教学中,对于提高病理生理学的教学质量具有重要意义。通过将自身的科研成果融入到病理生理学的教学中,不但显著提高了病理生理学的教学质量,更为重要的是培养了学生的学习兴趣、科研思维和创新精神。 相似文献
7.
目的:构建p38调节/激活蛋白激酶(PRAK)不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞中表达后,观察这些突变体在细胞内的定位情况.方法:将克隆在绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上的野生型PRAK通过定点突变技术构建其无活性突变体PRAK(T182A)、活性突变体PRAK(T182D)、无激酶活性突变体PRAK(KM)、核定位信号缺失突变体PRAK(NLSm)及核输出信号缺失突变体PRAK(NESm),随后转染NIH3T3细胞,并在荧光显微镜下观察其表达和细胞内定位情况.结果:经测序鉴定各种PRAK不同突变体正确无误后,在NIH3T3细胞中得到高量表达;融合蛋白发出的绿色荧光表明,在静息状态下,野生型PRAK(WT)、PRAK(182A)、PRAK(182D)、PRAK(KM)和PRAK(NESm)主要分布于细胞核内,而PRAK(NLSm)在细胞中均匀分布;在受到NaAsO2刺激后,PRAK(WT)和PRAK(KM)移位出核,而PRAK(182A)、PRAK(182D)和PRAK(NESm)失去了移位出核的能力,PRAK(NLSm)则与刺激前无明显差异.结论:成功构建了PRAK不同突变体的绿色荧光蛋白融合表达载体并在真核细胞中进行了表达,且不同的突变体能够影响PRAK的细胞内定位. 相似文献
8.
抗感染免疫是由天然(先天)免疫(innate immunity)和获得性(adapted immunity)免疫(适应性)共同介导的。病原微生物侵入机体后,天然免疫系统作为宿主的第一道防御线,对微生物进行识别和清除。天然免疫模式从低等生物到人类都非常保守,主要通过模式识别受体(PRR)对病原微生物表面保守、共有的基团,即病原体相关分子模式(PAMPs)进行天然识别。 相似文献
9.
目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。 相似文献
10.
目的:为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法:从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-1上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定,将重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red转染NIH3T3细胞,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果:PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red的构建正确,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的95%以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞,转染后48-60h开始出现,96-144h为红色荧光蛋白(RFP)的表达高峰,RFP的荧光在144h最强,168h后红色荧光逐渐消退,21d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子pCMVIE驱动的RFP。结论:成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,它们能在哺乳动物细胞中有效表达,静息状态下呈现弱转录活性,为研究人eNOS启动子不同区及其顺式调控元件的作用提供了实用而又方便的工具。 相似文献