促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除对烧伤后早期小鼠巨噬细胞趋化和组织细菌移位的影响

目的观察促肾上腺皮质素释放激素(CRH)基因敲除的烧伤小鼠腹腔巨噬细胞趋化功能变化及其与组织细菌移位的关系。方法选用3种CRH基因型:野生型(+/+),杂合子(+/-),纯合子(-/-)小鼠,以凝固汽油复制20%的Ⅲ度烧伤模型,伤后6小时和24小时分别以腹腔灌洗法提取腹腔巨噬细胞,观察其趋化功能变化;并以血琼脂平板培养法,观察肝、肺和肠系膜淋巴结细菌移位情况。结果 CRH-/-小鼠烧伤后,腹腔巨噬细胞趋化功能较CRH+/+烧伤小鼠显著减弱,伤后6小时趋化指数(14.05±5.54)低于伤后野生型(27.1±8.61)(P0.05),CRH-/-小鼠肝、肺和肠系膜淋巴结细菌菌落数显著高于CRH+/+和CRH+/-烧伤小鼠,以肠系膜淋巴结最为显著(P0.01);伤后24小时CRH-/-小鼠肠系膜淋巴结菌落数(974±356.75)和细菌移位率(100%)分别显著高于野生组小鼠肠道菌落数(574±191.4)和细菌移位率(40%)(P0.01),伴肠道炎性损伤加重。结论创伤应激早期,CRH基因敲除显著削弱机体天然免疫功能。     

促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除小鼠的繁殖与基因型鉴定

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因敲除(KO)小鼠饲养、繁殖及基因型鉴定的方法。方法从美国Jackson实验室引进CRH KO小鼠,按照遗传学规则,对杂合子型(CRH+/-)小鼠进行配对繁殖,提取幼鼠尾部组织全基因组DNA,通过聚合酶链反应(PCR)对幼鼠基因型进行鉴定。结果 CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠的繁殖和饲养均获得成功,采用PCR成功地对所获得的小鼠进行基因分析,在子代小鼠中存在野生纯合子型(CRH+/+)、杂合子型(CRH+/-)及CRHKO纯合子型(CRH-/-)小鼠。CRH-/-小鼠较另外2种基因型小鼠存活率明显下降,但3种基因型小鼠在出生后10 d及30d体质量无明显差异。结论正确的饲养繁殖以及鉴定方法可从杂合子型(CRH+/-)小鼠中获得CRH KO纯合子型(CRH-/-)小鼠。     

巨噬细胞趋化检测方法的建立及皮质酮对其趋化功能的影响

目的 建立改良Boyden趋化小室(Boyden chamber)法检测巨噬细胞趋化功能的方法,探讨皮质酮对大鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响.方法 分离成年Sprague-Dawley(SD)大鼠腹腔巨噬细胞.应用48孔Boyden chamber趋化板检测趋化功能.下室加入27μL的10nM FMLP作为趋化剂或含1%牛血清清蛋白的RPMI-1640作为阴性对照,将50μL不同细胞密度的大鼠腹腔巨噬细胞悬液(3、6、12×106/mL)置于上室以确定最适细胞密度,将趋化装置置于5%CO2、37℃细胞培养箱内孵育2、3h以确定最适孵育时间.同时,以0、10、50、1 000ng/mL皮质酮处理大鼠腹腔巨噬细胞,应用Boyden chamber法检测巨噬细胞趋化功能.结果 巨噬细胞对10nM FMLP趋化剂呈细胞密度依赖性增加,上室巨噬细胞密度为6×106/mL时为最适细胞密度,并且最适孵育时间为3h.低浓度皮质酮(10、50ng/mL)处理大鼠腹腔巨噬细胞其趋化指数显著高于对照组(P＜0.01),而高浓度皮质酮(1 000ng/mL)处理后巨噬细胞趋化指数与对照组相比差异不明显.结论 成功建立了改良Boyden chamber法检测巨噬细胞趋化功能方法,皮质酮可呈剂量依赖性地影响巨噬细胞趋化功能,在无免疫刺激状态下,低浓度皮质酮能增强巨噬细胞趋化功能.     

大鼠角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白表达的实验研究

目的探讨角膜缘上皮细胞的体外培养以及碱烧伤后β-连环蛋白(β-catenin)的表达规律。方法消化法培养大鼠角膜缘上皮细胞,并对其生物学特征[细胞形态、泛角质蛋白抗体(AE1/AE3)和细胞核增殖抗原(PCNA)]做初步鉴定;构建体外碱烧伤模型,利用实时定量聚合酶链反应和免疫荧光技术检测伤后各时相点β-catenin的表达。结果体外培养的角膜缘上皮细胞具典型的上皮细胞特点,大部分细胞分化程度较低且生活状态良好;核酸和蛋白水平均显示,伤后24小时β-catenin的表达有显著升高(P0.05),至伤后48小时达到峰值(P0.01)。结论在一定程度上可以利用角膜缘上皮细胞的研究结果来近似反映角膜干细胞的特点;Wnt经典信号途径参与了碱烧伤后的细胞修复过程。     

利用生物信息学技术挑选TLR2基因标签单核苷酸多态性位点

目的利用生物信息学技术挑选中国人群中的TLR2基因标签单核苷酸多态性(SNP)位点。方法利用NCBI数据库,确定TLR2基因研究范围,并利用Hapmap数据库下载中国人群的TLR2基因的SNPs数据;使用Haploview4.0软件对TLR2基因进行了连锁不平衡分析;通过对D值95%可信区间上下限的分析,在整个TLR2基因范围内构建单倍域(haplotype block);然后根据单倍域内SNPs之间的r2值和LOD值,挑选标签SNP;最后根据单倍域内的单倍型所占比例,挑选出标签SNP代表的单倍型。结果在中国人群中,TLR2全基因范围内共构建2个单倍域,挑选出3个标签SNPs(3013A/G、19216T/C、22215G/T)。同时,确定了单倍域内的标签SNPs分别代表的单倍型。结论中国人群的TLR2基因的3个SNPs位点(3013A/G、19216T/C、22215G/T)是最有代表性的标志性位点,可被选为标签SNPs,并指导中国人群TLR2基因与脓毒症关联研究。     

巨噬细胞趋化检测方法的建立及皮质酮对其趋化功能的影响

目的建立改良Boyden趋化小室（Boydenchamber）法检测巨噬细胞趋化功能的方法,探讨皮质酮对大鼠腹腔巨噬细胞趋化功能的影响。方法分离成年Sprague—Dawley（SD）大鼠腹腔巨噬细胞。应用48孔Boydenchamber趋化板检测趋化功能。下室加入27μL的10nMFMLP作为趋化剂或含1％牛血清清蛋白的RPMI一1640作为阴性对照,将50μL不同细胞密度的大鼠腹腔巨噬细胞悬液（3、6、12×10^6／mL）置于上室以确定最适细胞密度,将趋化装置置于5％C02、37℃细胞培养箱内孵育2、3h以确定最适孵育时间。同时,以0、10、50、1000ng／mL皮质酮处理大鼠腹腔巨噬细胞,应用Boydenchamber法检测巨噬细胞趋化功能。结果巨噬细胞对10nMFMLP趋化剂呈细胞密度依赖性增加,上室巨噬细胞密度为6×10^6／mL时为最适细胞密度,并且最适孵育时间为3h。低浓度皮质酮（10、50ng／mL）处理大鼠腹腔巨噬细胞其趋化指数显著高于对照组（P〈0．01）,而高浓度皮质酮（1000ng／mL）处理后巨噬细胞趋化指数与对照组相比差异不明显。结论成功建立了改良Boydenchamber法检测巨噬细胞趋化功能方法,皮质酮可呈剂量依赖性地影响巨噬细胞趋化功能,在无免疫刺激状态下,低浓度皮质酮能增强巨噬细胞趋化功能。     

珊瑚姜油对常见耐药菌的抑菌作用及急性毒性实验

目的研究珊瑚姜油(Zingiber corallinum Hanceoil)对耐药菌的作用以及珊瑚姜油的急性毒性,以确定珊瑚姜油的抗菌作用和安全性。方法纸片法药敏实验,探讨珊瑚姜油对耐药菌的抑菌作用。通过空腹灌胃法,观察珊瑚姜油对小鼠毒性反应,测定半数致死剂量(LD50)。结果珊瑚姜油对耐药革兰阴性大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟杆菌、鲍曼不动杆菌有明显的抑菌作用(P<0.05),对铜绿假单胞菌的抑菌作用不明显,但与对照组比较差异仍有统计学意义(P<0.05);对耐药革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌也有一定的抑菌作用(P<0.05)。松油烯-4-醇含量为79%的珊瑚姜油的抑菌作用明显好于含量为34%的珊瑚姜油(P<0.05)。珊瑚姜油LD50为1 790.427 mg/kg。结论珊瑚姜油为低毒性药物,对耐药菌有明显的抑菌作用,松油烯-4-醇是其主要的抑菌成分。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件的优化及生物学特性

目的建立一种新的高效体外骨髓间充质干细胞纯化培养方法,并对所获得细胞进行生物学行为研究。方法采用全骨髓培养获得原代骨髓间充质干细胞,经体外成脂、成骨诱导分化并检测细胞表面分子表达对所获得干细胞进行鉴定,传代后低密度接种(3×103/cm2)结合机械擦除对所培养细胞进行纯化,并对未纯化及纯化细胞分别进行集落形成单位实验、生长曲线及细胞周期分析来研究其生物学特性。结果全骨髓贴壁法可以成功培养出骨髓间充质干细胞,细胞呈现干细胞特性生长;可在体外成功地进行成脂、成骨分化;阴性表面标记分子CD34、CD45表达率均小于2%,阳性表面标记CD73、CD90表达率均高于95%。经纯化后的细胞具有更优的生物学行为,表现在:克隆形成率达到(28.80±5.00)%(P<0.01);培养12d后细胞数量增加(26.18±4.80)倍(P<0.05);处于S+G2/M期的细胞比例达到(45.98±1.60)%(P<0.01)。结论低密度接种结合机械擦除方法可以获得高纯度骨髓间充质干细胞,且该细胞具有更佳的生物学特性。     

无创脑水肿动态监测仪对急性脑损伤诊断价值的Meta分析

目的对无创脑水肿动态监测仪诊断急性脑损伤的文献进行荟萃分析,评价无创脑水肿动态监测仪对脑出血、颅脑外伤及脑梗死的诊断价值。 方法使用中国生物医学文献、万方医药、中国知网、PubMed等数据库检索无创脑水肿动态监测仪相关中英文文献。以急性脑损伤患者健侧扰动系数为对照组,对纳入的文献进行质量评价,并提取相关数据进行研究。数据分析采用Review Manager 5.4版软件。检验纳入文献的异质性,采取单篇文献排除法进行敏感性分析,并绘制森林图计算各亚组扰动系数对比的OR值。 结果最后纳入文献共计8篇,存在异质性,按发病类型进行亚组分析。亚组分析结果：发病后1 d脑出血及颅脑外伤患者大脑患侧扰动系数均显著低于健侧,OR值分别为-2.57（95%CI：-3.01~-2.13）、-0.83（95%CI：-1.02~-0.63）,而发病后3、7 d脑出血及颅脑外伤患者大脑患侧扰动系数均显著高于健侧;发病后1、3、7 d脑梗死患者大脑患侧扰动系数均显著高于健侧,OR值分别为0.75（95%CI：0.39~1.10）、0.61（95%CI：0.32~0.90）、0.50（95%CI：0.01~0.99）;发病后脑出血、脑梗死及颅脑外伤患者1~3 d扰动系数变化幅度均显著大于3~7 d,OR值分别为3.30（95%CI：3.11~3.50）、1.03（95%CI：0.08~1.98）、2.23（95%CI：2.09~2.38）。 结论无创脑水肿动态监测仪对急性脑损伤患者的扰动系数监测符合脑水肿发生的基本病理生理规律,反映了患者脑水肿严重程度变化的动态过程,可作为急性脑损伤患者的临床辅助诊断方法,帮助临床医生动态了解患者的脑水肿情况。