NS2TP基因启动子报告基因载体的构建及其活性验证

目的研究丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因（NS2TP）的转录调节机制。方法应用PCR方法扩增NS2TP的启动子,克隆入pGL4.10载体,构建萤虫素酶报告基因载体,转染HepG2细胞,检测双萤虫素酶活性,验证其转录活性;通过缺失突变法构建系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体。结果成功构建了系列截短的NS2TP基因启动子报告基因载体,分别命名为N1、N2、N3和N4,并确定了N3为NS2TP基因的核心启动子。结论构建NS2TP基因启动子的系列截短报告基因载体,确定了其最小转录活性区域,为进一步研究NS2TP基因的转录活性调节机制奠定理论基础。     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活蛋白2基因在酵母细胞中的表达

目的为探讨丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2)的功能,在真核生物酵母细胞中表达HCV FTP2基因.方法以HepG2细胞来源的mRNA作为模板,经过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HCV FFP2基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达.提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot免疫印迹分析.结果成功构建HCV FTP2基因酵母表达载体,Western blot免疫印迹显示HCV FTP2基因在酵母细胞中表达成功.表达产物相对分子质量27kD.结论HCV FTP2在酵母中表达成功.     

应用抑制性消减杂交技术克隆筛选丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2反式激活基因

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建新基因丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白2(HCVFBP2)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVFBP2反式激活相关基因.方法:以HCVFBP2表达质粒pcDNA3.1(-)-FBP2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建人类新基因HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后选取48个克隆,进行菌落PCR分析,均得200～1000bp插入片断.挑取30个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得28个已知功能基因序列和2个未知功能基因.结论:应用SSH技术成功构建了HCVFBP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明HCVFBP2生物学功能提供理论依据.     

β2-微球蛋白对乙型肝炎病毒核心启动子转录活性的调节作用

目的:研究β2-m对核心启动子表达的调节作用.方法:根据HBV核心启动子及β2-微球蛋白的序列设计引物,用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和β2-微球蛋白基因,分别构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白的真核表达载体,脂质体法瞬时转染HepG2细胞.结果:成功构建HBV核心启动子的报告载体及β2-微球蛋白(β2m)的真核表达载体.脂质体法瞬时转染HepG2细胞48 h后,核心启动子在β2-微球蛋白(β2_m)的影响下,其启动子活性降底2倍.结论:β2-微球蛋白(β2-m)明显HBV核心启动子的表达.     

应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因

目的 筛选干扰素β（IFN-β）启动子DNA结合蛋白的基因，探讨IFN-β基因调节的分子生物学机制。方法 应用噬菌体展示技术，以IFN-β启动子DNA的聚合酶链反应（PCR）产物作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选过程，噬斑PCR扩增后，对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果 噬菌体经富集后，随机挑选52个克隆，序列测定后经过同源性搜索，确定与IFN-β启动子具有结合作用的肝细胞蛋白有6种，包括谷胱甘肽S-转移酶（GST），淀粉酶突变体蛋白，锌指蛋白等与细胞发育和代谢有关的蛋白。结论 IFN-β启动子DNA与肝细胞中多种蛋白类型结合，为研究IFN-β基因在肝细胞中的表达调控奠定了基础。     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒增强子Ⅰ结合蛋白的研究

目的　通过筛选乙型肝炎病毒 (HBV)增强子Ⅰ (Enhl)结合蛋白 ,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法　应用噬菌体展示技术 ,以HBV的增强子Ⅰ的聚合酶链反应 (PCR)产物DNA作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 4轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果　噬菌体经富集后 ,从随机筛选的 12个克隆中得到 6个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV增强子Ⅰ结合的肝细胞蛋白 ,共编码 3种蛋白。分别为 3 磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶、人类血清白蛋白、核膜孔复合体相互作用蛋白。结论　用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV增强子Ⅰ结合的蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,可能是作用于增强子Ⅰ的反式作用因子 ,但它们对HBV增强子Ⅰ是否有转录调控作用还需进行进一步的研究证实。     

抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒F蛋白的反式调节基因

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）F蛋白反式激活相关基因差异表达的差异cDNA，克隆HCV-F蛋白反式激活相关基因。方法 以HCV-F表达质粒pcDNA3．1（-）-F转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1（-）为对照；制备转染后的细胞裂解液，从中提取mRNA并合成cDNA，经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆聚合酶链反应后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HcVF蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA。扩增后得到56个200～1000bP插入片段的克隆，随机挑选其中28个插入片段测序，并通过生物信息学分析获得其全长基因序列，结果共获得19种编码基因，其中2个为未知功能的新基因。结论 筛选到的cDNA全长序列，包括一些与细胞生长调节、物质代谢和细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因。     

应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1的反式调节基因

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒DNAPTP1反式激活的新型靶基因．方法:以HBV DNAPTP1表达质粒pcDNA3．1(-)- DNAPTP1 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建 cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析．结果:成功构建DNAPTP1反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库．文库扩增后得到60个白色克隆,经菌落PCR分析,得到32个200-1 000 bp插入片段．对所得片段测序,并进行同源性分析,获得3个差异表达的已知蛋白基因和4个未知功能的染色体序列．结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了DNAPTP1可能存在的调控机制的线索．