CR2-CD59和CD59-CR2靶向补体抑制物的构建、表达与鉴定

CD59是补体的细胞膜抑制剂,它通过与C8和C9结合,可达到阻止MAC(membrane attack complex)组装的目的.而且CD59不影响补体调理素、C3a或C5a的产生.目前研究结果表明可溶性CD59(soluble forms of CD59,sCD59)对补体相关疾病的治疗作用甚微[1,2].直接将靶向补体抑制物定位至补体相关疾病位点的策略可能提高对补体的抑制效率,同时可以避免由于系统性和长期性补体抑制带来的副作用.已有研究表明,抗体-CD59靶向融合蛋白比非靶向补体抑制物能更有效保护目标细胞[3].因此,本研究拟采用可溶性CR2作为将补体抑制物(CD59)定位至补体相关疾病位置的载体,从而构建一种更有效的靶向补体抑制物,使其只对补体激活位点产生抑制,而不影响机体免疫系统正常的补体调节,为研制炎症相关性疾病新的治疗药物奠定基础.     

脂肪乳注射液输注致血小板减少一例

患者女,82岁.因"血糖升高6年,发热1d"于2011年1月5日入我院.患者同时患有老年痴呆,拒绝饮水,因置胃管不配合,以深静脉肠外营养为主,同时开导患者尽量增加肠内营养.肠外营养以20％中/长链脂肪乳注射液、氨基酸注射液、维生素、微量元素、丙氨酰谷氨酰注射液为主.     

CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物的构建、表达与鉴定

目的: 构建针对补体激活物的特异靶向补体抑制物, 并对其进行体外活性鉴定.方法: 将补体受体(CR2)与补体抑制物(促衰变因子, DAF)以融合表达方式(顺反结构)克隆到表达载体PBM中, 然后将重组体转移到CHO细胞中进行蛋白表达, 用SDS-PAGE、 Western blot、流式细胞术(FCM)检测、 SPR检测及补体介导的细胞溶解实验对表达的融合蛋白进行生物学活性鉴定.结果: SDS-PAGE和Western blot结果显示出现预期大小的目标片段.FCM与SPR检测结果显示, 重组蛋白CR2-DAF与DAF-CR2能特异地与C3包被的CHO细胞、 C3dg配基相结合.补体介导的细胞溶解实验结果显示, 靶向补体抑制物比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显(CR2-DAF的抑制效率高达20倍).结论: 成功构建了CR2-DAF和DAF-CR2靶向补体抑制物, 为下一步进行动物体内补体抑制实验奠定了基础.     

盐酸克伦特罗生物素化单链抗体在大肠埃希氏菌中的表达

目的 提取盐酸克伦特罗(CLB)生物素化抗体片段蛋白进行表达,为下一步纯化及农兽药品快速检测奠定基础。方法 确定一株生物素化CLB噬菌体抗体 “pHEN1-BHNS-CLB1”对其进行蛋白表达,即从噬菌粒“PHEN1-BHNS-CLB1”切下scFv基因片段,亚克隆至能引导可溶性表达的载体pCANTAB5E上,完成了重组质粒的构建,将所构质粒转化大肠埃希氏菌感受态细胞BL21。命名“5E-BHNS-CLB1”,并对“5E-BHNS-CLB1”进行PCR及酶切鉴定后,测序分析。结果 ELISA结果证明其具有较好的亲和性,竞争抑制ELISA、与gp120蛋白及三聚氰胺的交叉反应ELISA结果均证明其具有很好的特异性,片段大小与预想目的片段大小一致,SDS-PAGE及Western blotting的结果显示,其分子量大小与目的一致,并能与抗E-tag标签抗体结合显色。结论 说明表达的蛋白能与表达载体5E后带有E-Tag标签的短肽作用,含有E-Tag标签,是我们要表达的目的蛋白,为下一步纯化蛋白创造了条件。     

人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体筛选与鉴定

目的 以人类免疫缺陷病毒(HIV-1)gp120 V3环的合成环肽为抗原,从人的噬菌体抗体组合文库中筛选出与抗HIV-1 V3肽有结合活性的人源噬菌体抗体(Fab段).方法 用噬菌体抗体库技术筛选人源抗HIV-1V3环噬菌体抗体,ELISA测定其活性,竞争抑制实验证实了该噬菌体抗体的特异性.结果 序列分析表明.重链基因为IgG1亚类,可变区属VHI亚群.与胚系基因DP-88同源性最高,D区为D3-3、J区为JH5;轻链为k亚型.可变区属VL IV亚群,D区为DPK22,J链为Jk4胚系.结论 成功筛选了人源抗HIV-1 V3环噬菌体抗体.其具有很好的生物学活性和特异性.     

我国不同地区HCV感染者抗-HCV反应性

目的 研究我国不同地区丙型病毒性肝炎(HCV)感染者抗-HCV反应性.方法 收集部分地区HCV感染者血清363份,分别进行抗-HCV ELISA和抗-HCV中和抑制试验.结果 我国不同地区(甚至同一地区不同民族)HCV感染者抗-HCV抑制率不同,而且中和抑制试验前后平均A值的差异也有所不同,特别是西藏地区藏族和新疆地区维吾尔族分别只有3.2%和30.8%抗-HCV( )血清能被同种多肽抗原所抑制.结论 我国不同地区人群HCV感染者的抗-HCV免疫反应性不同,并可能与不同地区的HCV变异性有关.     

三聚氰胺人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,分别以三聚氰胺、生物素化三聚氰胺作为包被抗原,从噬菌体抗体文库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选阳性克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对比后获得与抗原结合活性较好的克隆提取质粒,亚克隆到pCANTAB5E载体,对其重组质粒进行分析.结果 质粒酶切片段与目的相符.结论 利用生物素化抗原筛选抗体创新了原有筛选方法,为下一步研究创造条件.     

抗盐酸克伦特罗人源ScFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选盐酸克伦特罗(CLB)人源单链可变区(ScFv)抗体,为研究快速检测试剂(盒)提供基础依据.方法 采用噬菌体表面展示技术,以CLB作为抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选抗CLB的60个克隆,利用酶联免疫吸附法(ELISA)、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与CLB结合活性较强的ScFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XLI-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;并对CLB ScFv的编码基因序列分析.结果 经过筛选60个克隆中有15株克隆ELISA的吸光度(A490nm)值较高,将这些噬菌体上清与牛血清白蛋白(BSA)进行交叉反应,确定有7株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行DNA序列测定;DNA为750 bp;经BLAST分析,此片段属于新抗体基因序列,GenBank注册号为:EU681272.结论 本实验用噬菌体抗体库技术能够初步获得抗CLB的ScFv抗体,为下一步其特异性亲和力的研究创造了条件.     

抗生物素化三聚氰胺人源单链可变区抗体筛选与鉴定

目的筛选生物素化三聚氰胺人源单链可变区(scFv)抗体,为研究相关快速检测试剂盒创造条件。方法本试验利用生物素化三聚氰胺为包被抗原,从半合成噬菌抗体库中筛选其特异性噬菌体抗体片段。即采用菌噬体表面展示技术,以链亲和素-生物素标记的三聚氰胺为固相包被靶抗原,把靶抗原包被在免疫平板上,加入噬菌体抗体库,则头部带有能与靶抗原特异性结合的抗体分子的噬菌体就被固定在免疫平板上,不能特异结合的噬菌体则被漂洗掉;将特异结合的噬菌体洗脱下来,侵染大肠杆菌,就可以得到含抗体基因的噬菌粒。结果从半合成的菌噬体单链可变区抗体库中经过3轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程后,获得抗原特异性和结合性较强的生物素化三聚氰胺scFv片段。结论酶联免疫吸附试验等进行鉴定后,筛选得到了抗生物素化三聚氰胺的噬菌体抗体基因片段,为下一步亲和力鉴定、蛋白表达及开发相关检查试剂盒奠定了基础。     

华通胶间充质干细胞低温保存后生物学特性研究

本研究旨在探讨低温保存对华通胶间充质干细胞（wJ-MSC）生物学特性的影响,为低温保存后WJ-MSC的临床应用及建立WJ-MSC库提供实验依据。通过脐带组织块培养制备WJ-MSC,将第5代WJ-MSC加入低温保护剂,-80℃冰箱降温,液氮保存。细胞复温后行培养和传代,低温保存组第1代（PP1）传代获得PP2-PP15。非低温保存组第6代为对照组第1代（CP1）,传代获得CP2-CP15。比较对照组与低温保存组WJ-MSC的有核细胞回收率、台盼蓝拒染率、CCK-8活性、凋亡率、贴壁率、增殖指数、细胞表面抗原、细胞周期和向脂肪细胞、成骨细胞及神经元细胞诱导分化能力。结果表明,WJ-MSC经低温保存,有核细胞回收率为98．2％,台盼蓝拒染率为94．3％,CCK-8活性为91．4％,凋亡率为3．9％,贴壁率为92．6％;PP1较CP1增殖指数明显降低（P〈0．05）,PP2-PP15与相应对照组增殖指数的差异均无统计学显著性;WJ-MSC高表达CD29、CD90、CD44、CD71、CD73、CDl05、CDl66和HLA-ABC,低表达CD34、CD45和HLA-DR,两组之间差异均无统计学显著性;增殖潜伏期和对数增殖期两组之间差异也无统计学意义;向脂肪细胞、成骨细胞和神经元细胞诱导分化后分别进行油红0、碱性磷酸酶（ALP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色,两组间阳性强度肉眼观察无明显差异;细胞内甘油三酯、ALP和NSE含量两组间也无显著差异。结论：WJ-MSC低温保存后少量细胞（〈10％）受到损伤,传代培养表明其生物学特性基本保持不变。