幽门螺杆菌尿素酶B亚单位和热休克蛋白A亚单位的融合表达

目的将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因融合,并实现其在大肠杆菌中的表达,为构建该菌的基因工程二价苗打下基础.方法通过交叠延伸拼接PCR法将幽门螺杆菌ureB基因和hspA基因通过(Gly4Ser)3linker连接起来,经NcoⅠ和NotⅠ双酶切后定向克隆入表达载体pET22b+的pelB前导序列下游,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL31(DE3),用1PTG诱导表达.结果幽门螺杆菌的尿素酶B亚单位基因和热休克蛋白A亚单位基因通过linker获得了融合,序列分析表明,此融合基因序列拼接正确,且是通读的.含有该融合基因表达载体的表达菌株BL31(pET-BA)在30℃经IPTG诱导表达4h后,用10%SDS-PAGE电泳分析表明,在细菌周质表达有约与预期融合基因表达蛋白大小一致的外源蛋白质表达带.结论幽门螺杆菌ureB与hspA成功地实现了在大肠杆菌中的融合表达,为进一步评价其对Hp的免疫保护效果和构建Hp二价基因工程苗打下了基础.     

利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白抗原

目的:利用小鼠感染模型筛选与鉴定幽门螺杆菌SS1株的外膜蛋白抗原。方法:提取SS1株的外膜蛋白进行双向电泳,用幽门螺杆菌感染的小鼠血清作免疫印迹实验,将阳性反应蛋白点进行质谱鉴定分析,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索。结果:获得32种抗原相关蛋白。通过与已有报道的幽门螺杆菌感染人抗原比较分析,发现大部分典型的保护性抗原在本实验中都可以检测到。结论:幽门螺杆菌感染的小鼠模型适用于人用保护性幽门螺杆菌抗原的筛选;而且此研究中得到的相关抗原蛋白对于寻找与鉴定幽门螺杆菌未知保护性抗原也有参考价值。     

幽门螺杆菌靶向核酸疫苗的构建及免疫学评价

目的:为了提高幽门螺杆菌DNA疫苗的免疫原性,构建具有靶向作用于APC细胞的核酸疫苗.方法:利用基因工程技术,将靶向基因片段和过氧化氢酶基因融合构建了核酸疫苗.体外转染293T细胞,间接免疫荧光和ELISA检测其基因表达情况.用该核酸疫苗肌肉免疫注射BALB/c小鼠后,测定其血清IgG、IgG1和IgG2a水平.结果:间接免疫荧光检测转染DNA疫苗的293T细胞,表明该疫苗能在真核细胞中表达目的抗原,通过ELISA方法测定表明其仍具有IgG抗体结合能力.BALB/c小鼠免疫后血清测定结果表明,该靶向核酸疫苗诱导的抗体水平高于对照质粒pDNAkat,抗体分型实验显示靶向核酸疫苗pcDNAkathIgz和pcDNAkat,促进了免疫反应类型由Th2向Th1的部分偏转.结论:成功构建了靶向APC细胞的幽门螺杆菌核酸疫苗,并在小鼠体内诱导了较高的抗体水平.     

重组人白细胞介素6部分理化生物学性质的鉴定

目的：对Ｎ端缺失５个氨基酸的重组人白细胞介素６纯品的理化生物学性质进行分析鉴定。方法：用蛋白序列自动分析仪,紫外及可见光扫描仪,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳,溴化氰裂解,等电聚焦电泳、蛋白质印迹法和ＭＴＴ比色法分别对ｒｈＩＬ－６缺失体Ｎ端氨基酸序列,紫外及可见光吸收光谱、相对分子质量、肽图,等电点（ｐＩ）,抗原特ｒｈＩＬ－６ｒｈＩＬ－６缺失体Ｎ端氨基酸序列,紫外及可见光吸收光谱、肽图、等电点（ｐＩ）     

幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答

目的　构建H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株 ,并进行初步的免疫原性分析。方法　将H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A asd质粒的多克隆位点之内。挑取单菌落质粒鉴定后 ,分别将其电击经中间宿主X3730转入最终宿主X4 0 72 ,SDS PAGE和Westernblot检测蛋白表达。将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB c小鼠。结果　疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量 (Mr)为 6 4× 10 3的UreB蛋白及 77× 10 3的UreB HspA融合蛋白。在免疫BALB c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H .pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体。结论　构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株 ,为探索制备H .pylori口服活菌疫苗奠定了基础。     

幽门螺杆菌长期感染蒙古沙土鼠导致胃炎、胃溃疡的实验研究

目的：用幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)长期感染蒙古沙土鼠建立胃炎、胃溃疡的动物模型。方法：蒙古沙土鼠经过禁食、禁水预处理之后，采用国际标准菌株H.pylori ATCC 43504灌胃，在末次灌胃动物后4，8，12，24，48，52周分别对H.pylori感染组和正常对照组蒙古沙土鼠的胃黏膜进行H.pylori形态学(涂片和细菌培养)、H.pylori快速尿素酶检测、H.pylori特异性PCR检测和病理组织学观察，并对血清中抗H.pylori IgG抗体进行了检测。结果：H.pylori感染组动物以上各项指标均为阳性，表明已经感染H.pylori；而正常对照组则以上各项均为阴性。病理组织学观察表明感染组8周即可见到慢性炎症性病变，12周时黏膜层和黏膜下层可见到淋巴滤泡，24周胃窦部可见到胃溃疡。结论：H.pylori ATCC 43504可以长期定植于蒙古沙土鼠腺胃，能够产生与H.pylori感染人胃黏膜相似的病理改变。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合表达产物的初步纯化及其在小鼠体内免疫效应活性分析

目的 :探讨幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白的免疫生物学活性。方法 :采用亲和层析、离子交换和凝胶过滤对幽门螺杆菌热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白进行初步纯化 ,用粗纯化蛋白对小鼠进行免疫 ,然后分析其免疫活性。结果 :采用亲和层析或离子交换和凝胶过滤后 ,融合蛋白的纯度分别可达到 6 5 .6 %和90 .2 %。该融合蛋白可诱导小鼠产生抗幽门螺杆菌的胃肠黏液IgA和血清IgG抗体 ,并促使免疫小鼠脾脏T淋巴细胞CD4 CD8 比值的增加。结论 :重组热休克蛋白A与尿素酶B融合蛋白可以诱导在未来免疫预防中起积极作用的免疫应答反应