Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

MecA、Nuc基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测中的应用

目的通过对180株金黄色葡萄球菌临床分离株MecA、Nuc基因的检测,以期选择出一种适合临床的并能简便、快速、准确检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的方法。方法细菌鉴定及药敏采用全自动细菌鉴定和药敏分析仪。MecA、Nuc基因检测采用荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）法。结果FQ-PCR对180株金黄色葡萄球菌MecA、Nuc基因检出率为75.0%,全自动细菌鉴定和药敏分析仪对180株金黄色葡萄球菌的MRSA检出率为72.8%,2种检测方法比较差异无统计学意义（P＞0.05）。全自动细菌鉴定和药敏分析仪对MRSA的检测正确率为94.8%。结论FQ-PCR检测MRSA正确率高,只需要1～2 h即可完成。该方法快速、简便、准确,值得推广应用。     

荧光定量PCR快速检测在病毒性角膜炎诊疗中的应用

目的 为病毒性角膜炎的患者进行疱疹病毒病原学快速检测,根据检测结果指导临床治疗。方法 选取未进行抗病毒药物治疗的患者,根据病情分别取其泪液或病变区角膜上皮细胞,用荧光定量PCR方法对单纯疱疹病毒（herpessimplex virus,HSV）1型、HSV2、水痘-带状疱疹病毒（varicella zoster virus,VZV）、人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）和EB病毒（EB virus,EBV）的核酸进行定量检测。结果 90例病毒性角膜炎患者中有54例检测出疱疹病毒核酸,检出率为60.0%;发病后首次就诊的病毒性角膜炎患者中疱疹病毒核酸的检出率为94.7%,明显高于多次发作后就诊的患者（检出率为34.6%）,2者差异比较具有统计学意义（P<0.001）。发病后首次就诊的病毒性角膜炎患者感染的主要病毒为HSV1、EBV和HSV2,多次发作后就诊的患者感染的病毒主要为HSV1和HCMV。5种疱疹病毒中HSV占病毒检出数的74.0%,上皮型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为30.6%,基质型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为95.1%,基质型角膜炎中疱疹病毒检出率高于上皮型角膜炎(P<0.001）。上皮型角膜炎中HSV1病毒的检出率和平均拷贝数明显高于其他病毒;基质型角膜炎中HSV1、HSV2病毒的拷贝数明显高于其他疱疹病毒拷贝数。结论 病毒性角膜炎患者应尽早进行核酸检测以明确疱疹病毒类型及拷贝数,检测结果为进一步的抗病毒治疗和疗效判断提供科学依据。     

多通道Taqman-探针荧光定量PCR 鉴定MRSA方法的建立

目的 建立基于mec A/nuc/fem B三基因联合的Taqman-探针荧光定量PCR鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法 以常规检验标本中分离和采用VITEK 2 Compact微生物分析仪鉴定为凝固酶阳性的MRSA为研究对象,通过PrimerPremier5.0和Beacon Designer 7软件设计针对mec A/nuc/fem B特异性PCR引物及Taqman荧光探针,荧光探针5'端分别采用FAM,HEX及ROX标记,3'端采用BHQ1标记,在荧光定量PCR仪进行检测。结果 ①1 g/dl凝胶电泳结果显示mec A/nuc/fem B三个基因引物特异性较好,扩增出的条带分子量与预期分子量一致且未见非特异性扩增; ②在单管单通道及单管多通道的PCR检测中mec A/nuc/fem B均获得特异性扩增,且三个基因在单管多通道的PCR扩增效果与单管单通道的相类似。结论 成功建立了多通道Taqman-探针荧光定量PCR鉴定MRSA的方法,mec A/nuc/fem B三种基因联合检测可有效区分凝固酶阴性和阳性的MRSA,提高鉴定MRSA的准确率。     

基于 LAMP技术针对溶藻弧菌 gyrB基因快速检测方法的建立

目的　应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）建立针对溶藻弧菌gyrB 基因的 快速检测方法。方法　以溶藻弧菌标准株（ATCC-17749）和溶藻弧菌野生株（WT）为研究对象,通过在线生物学软件（http:// primerexplorer.jp/e/）设计针对溶藻弧菌gyrB 基因的LAMP 引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快 速检测方法。结果　①经2g/dl 凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为 适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min 和90 min 凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min 能满足扩增需要; ③利用同一体系对临床6 种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀 释法验证该LAMP 体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论　建立了基于LAMP 技术针对溶藻弧菌gyrB 基因的快速检测方 法, 具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。     

细胞间黏附分子1及血清可溶性细胞间黏附分子1与肿瘤关系的研究进展

目的细胞间黏附分子1(ICAM-1)及血清可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)是一类黏附分子,其主要功能是介导细胞间接触、黏附及淋巴细胞的穿内皮。ICAM-1作为共刺激分子和信号转导分子来激活细胞内的信号通路,导致淋巴细胞的活化,细胞因子的分泌和促炎性瀑布的激发。ICAM-1能够介导细胞间连接,恶性肿瘤组织通过表达ICAM-1使得肿瘤细胞转移和侵袭能力增强,而血清sICAM-1不但是肿瘤免疫逃逸的重要手段,也与肿瘤的侵袭和转移密切相关。近年来研究发现,ICAM-1/sICAM-1在肿瘤中表达量增加与肿瘤的治疗效果及预后密切相关。