两种人NK细胞培养体系相关性研究

目的探讨人自然杀伤(NK)细胞小规模研究型培养体系与大规模临床制备型培养体系的相关性。方法分离11例健康志愿者的外周血,制备外周血单个核细胞(PBMCs),分别于小规模研究型培养体系与大规模临床制备型培养体系中进行诱导和扩增。比较两种培养体系下,人NK细胞的增殖倍数、细胞表型、相关活化受体以及细胞毒作用。结果第14天,两种培养体系下人NK细胞的增殖倍数、细胞表型以及细胞毒作用的方面比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论人NK细胞小规模研究型培养体系和临床制备型培养体系具有较好的一致性,前者可为后者的建立与优化提供稳定的研究模型,且能明显降低研究成本。     

形态学分型困难的白血病24例免疫分型

目的: 应用流式细胞仪对24例临床形态学诊断困难的急慢性白血病进行快速、有效地免疫分型,以指导临床化疗. 方法: 采用单克隆抗体双色直接免疫荧光标记法及多参数流式细胞术(FCM),分型根据抗体积分系统,并与FAB分型进行比较. 结果: ① 9例临床诊断慢性淋巴细胞白血病经FCM免疫分型确诊为B淋巴细胞性白血病;② 5例临床诊断急性淋巴细胞白血病(L2)的患者经FCM免疫分型确诊1例为B淋巴细胞性白血病;2例为T淋巴细胞性白血病,且1例伴红系异常改变; 1例为未分化型白血病;1例为淋巴细胞白血病B,T双表达;③ 5例急性非淋巴细胞性白血病经FCM免疫分型确诊2例为髓系白血病;3例为红白血病(M6);④ 1例MDS伴骨髓纤维化经FCM免疫分型确诊为M6;⑤ 4例疑似粒-淋双表型白血病经FCM免疫分型确诊为粒-淋双表型白血病. 免疫分型与FAB分型的符合率为79.2%. 结论: 流式细胞仪多参数白血病免疫表型分析,可以弥补FAB分型的不足,为临床诊断提供重要依据,并为白血病治疗措施的个体化提供依据.     

IL-15与IL-21细胞因子组合优化临床级人NK细胞培养体系

目的探讨IL-15、IL-21细胞因子组合建立的临床级人NK细胞培养体系对NK细胞增殖、免疫细胞表型和细胞毒作用的影响。方法分离9例健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs),根据以下3组进行扩增培养:(1)对照组(我科临床级人NK细胞培养体系),(2)IL-15组(对照组+IL-15),(3)IL-15/IL-21组(对照组+IL-15+IL-21)。台盼蓝拒染法计数细胞总数和活力;流式细胞术分析免疫细胞表型和NK细胞活化受体表达;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果培养至14 d,IL-15/L-21组细胞总数明显升高,NK细胞增殖倍数达到(761.68±449.30)倍,明显高于IL-15组,差异有统计学意义(P<0.05);IL-15/IL-21组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。3组培养物中CD3~-/CD56~+细胞百分率比较,IL-15/IL-21组和IL-15组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组中CD3~+/CD4~+细胞百分率均呈下降趋势,且IL-15/IL-21组和IL-15组明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组中总CD3~+细胞百分率比较,IL-15组明显低于对照组(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-15/IL-21组NKG2D活化受体表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但与IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组中CD3~+/CD56~+细胞百分率、CD3~+/CD8~+细胞百分率以及NKp46活化受体的表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。相同的效靶比,3组细胞的细胞毒作用比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论采用IL-15/IL-21组合优化人NK细胞培养体系,可以选择性地扩增NK细胞,提高培养物中NK细胞数量和细胞总数,以及活化受体NKG2D的表达水平,这将为优化临床级人NK细胞制备体系提供科学依据。     

携带B7-1基因的Hep-2细胞瘤苗诱导CIK细胞特异性抗肿瘤作用

目的探讨以转染B7-1基因的喉癌细胞Hep-2瘤苗刺激CIK细胞能否激活其特异性抗肿瘤杀伤活性。方法将以携带B7-1基因的重组腺病毒载体转染Hep-2细胞的瘤苗与CIK细胞共培养,检测CIK细胞的增殖率、表型改变、细胞毒活性。结果经21天培养后,对照组和转染组增殖倍数分别约为2216倍和5246倍,差异有非常显著意义(P<0.01);未转染组约为2299倍,与对照组相比差异无显著意义(P>0.05)。转染组CD3 CD56 细胞和CD3 CD8 细胞的百分含量明显高于对照组(P<0.01),而未转染组与对照组细胞表型改变无显著差异(P>0.05)。细胞毒杀伤实验中,在效靶比为40:1条件下,以Hep-2细胞为靶细胞时,转染组杀伤活性明显高于对照组(P<0.01),未转染组与对照组无显著差异(P>0.05),以K562细胞为靶细胞时,三组CIK细胞的毒性作用无明显差异(P>0.05)。结论转染B7-1的Hep-2细胞瘤苗与CIK细胞共培养,可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。     

CIK在无血清培养体系中的增殖、表型变化和抗肿瘤活性

目的:探索细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在无血清体系中的增殖规律、表型变化及其抗瘤活性。方法:不同培养基培养CIK细胞,采用活细胞计数法观察CIK细胞的增殖,流式细胞仪检测CIK细胞的表型,CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒检测CIK细胞的细胞毒活性。结果:经过细胞因子和抗体刺激后,CIK细胞能明显增殖,无血清培养基加自体血浆组最高可扩增473.28±27.53倍,无血清培养基组可扩增218.24±16.86倍,而RPMI1640加FCS只扩增11.52±1.04倍。CD3 CD8 、CD3 CD56 、CD226 CD11a 和CD305 CD11a 细胞随着培养时间的延长而增加,而CD3 CD4 细胞则明显减少。CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用明显高于LAK细胞(P<0.01),且其细胞毒活性随着培养时间的延长而增高。结论:CIK细胞在体外扩增能力强,对肿瘤细胞的杀伤活性高,有望成为新一代抗肿瘤过继免疫细胞制剂而应用于临床。     

肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3~+CD56~+细胞的体外扩增能力

目的探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)输注治疗对再次制备CIK细胞亚群的构成和活性的影响。方法选取经2个疗程CIK细胞治疗的患者201例,分为CIK治疗后90 d内(含90 d)制备检测组和大于90 d制备检测组。台盼蓝拒染法检测细胞增殖;流式细胞术分析CD3、CD4、CD8,CD56和NKG2D受体表达情况的变化;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果 CIK细胞输注治疗后90 d内再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞百分率(16.7±9.1)%,与CIK细胞输注治疗前相比(13.5±8.6)%,显著增加(P0.01),而且,表面受体NKG2D表达水平((84.1±10.8)%,也比CIK细胞输注治疗前明显增高((81.1±14.8)%)(P0.05)。与此相反,CIK细胞输注治疗后导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(15.2±9.7)%,与CIK输注治疗前(17.6±12.5)%相比,显著下降(P0.01)。值得注意的是,CIK细胞输注治疗后超过90 d再次制备CIK细胞的CD3+CD56+细胞分布和NKG2D受体表达,与CIK细胞输注治疗前相比均无明显变化,但CIK细胞输注治疗后仍可导致再次制备时,CIK细胞群体中CD3+CD4+百分率(14.5±9.4)%,与CIK细胞输注治疗前相比(18.2±12.9)%,明显下降(P0.01)。另外,2组再次制备CIK细胞的总数和体外细胞杀伤活性无明显差异。结论 CIK细胞输注治疗有助于提高肿瘤患者CD3+CD56+细胞前体细胞,在相同CIK细胞培养制备体系中增殖、定向分化和活化的能力,该作用持续时间不超过90 d,因此,CIK细胞治疗疗程间隔时间不应超过90 d。     

携带B7-1基因的Hep-2细胞瘤苗诱导CIK细胞特异性抗肿瘤作用

为探讨以转染B7-1基因的喉癌细胞Hep-2瘤苗刺激CIK细胞能否激活其特异性抗肿瘤杀伤活性,将以携带B7-1基因的重组腺病毒载体转染Hep-2细胞的瘤苗与CIK细胞共培养,检测CIK细胞的增殖率、表型改变、细胞毒活性。结果表明,经21天培养后,对照组和转染组增殖倍数分别约为2216倍和5246倍,差异有非常显著意义(P<0·01);未转染组约为2299倍与对照组相比差异无显著意义(P>0·05)。转染组CD3 CD56 细胞和CD3 CD8 细胞的百分含量明显高于对照组(P<0·01),而未转染组与对照组细胞表型改变无显著差异(P>0·05)。细胞毒杀伤实验中,在效靶比为40∶1条件下,以Hep-2细胞为靶细胞时,转染组杀伤活性明显高于对照组(P<0·01),未转染组与对照组无显著差异(P>0·05);以K562细胞为靶细胞时,3组CIK细胞的毒性作用无明显差异(P>0·05)。结论:转染B7-1的Hep-2细胞瘤苗与CIK细胞共培养,可提高CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,可能是该瘤苗诱导了CIK细胞特异性抗肿瘤免疫应答的结果,这为临床过继免疫治疗的应用提供了理论基础。     

Thymoglobulin与CD3单克隆抗体在细胞因子诱导的杀伤细胞制备中的作用比较

目的研究人胸腺球蛋白(TG)在临床治疗级培养体系中,对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)增殖、免疫细胞表型和细胞毒作用的影响。方法分离11例健康正常人外周血单个核细胞(PBMC),γ干扰素预处理;1 d后,TG或CD3 mAb刺激;随后,每3 d补充IL-2等添加物,培养至21 d。台盼蓝拒染法计数细胞总数和活力;流式细胞术分析CD3、CD4、CD8、CD16/CD56和NK细胞活化/抑制受体表达情况以及CD25+Foxp3+调节T细胞(Treg)的变化;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果 TG和CD3 mAb均能刺激CIK细胞生长,但CD3 mAb作用弱于TG。培养7 d,2组CIK细胞中,CD3+CD16+CD56+细胞、CD3-CD16+CD56+细胞及NK细胞活化/抑制受体表达均出现一过性减少;培养14 d,开始恢复,并持续增加至21 d;在7 d、14 d和21 d等3个检测点,CD3 mAb组的三者均低于TG组(P0.05),而且,细胞毒活性也低于TG组。值得注意的是,培养7 d,Treg一过性增加,且TG组明显高于CD3 mAb组(P0.05);另外,在整个培养期间,2组CIK细胞中,CD3+CD4+细胞持续减少,而CD3+CD8+细胞在7 d,即迅速增加,并维持该水平至21 d,这种改变在2组间无差异。结论 TG能选择性地促进CIK细胞中主要效应细胞增殖、分化和成熟,提高其细胞毒活性,因此,其具有替代CD3 mAb用于制备临床级CIK细胞制品的可行性;CD3 mAb和TG培养体系均可一过性地扩增负相调控细胞Treg,剔除或减少Treg可能有助于提高主要效应细胞产率。     

p27 kipl蛋白与雌、孕激素受体在子宫内膜组织中的表达及其意义

 目的　探讨 p2 7kipl、雌激素受体 (ER)与孕激素受体 (PR)在子宫内膜癌中的表达及意义。方法　用免疫组化法检测 6 6例子宫内膜癌、2 9例子宫内膜非典型增生病变和 31例正常子宫内膜组织中p2 7kipl蛋白及其癌组织中ER和PR的表达。结果　在癌组织中p2 7kipl的表达率为 5 3.0 % ,明显低于非典型增生病变的 75 .8%和正常子宫内膜的 87.1% ,并与其分级有关 ;ER和PR的表达与p2 7kipl相似。结论　p2 7kipl与此癌的发展和恶性程度有关 ,这对其治疗和预后有参考价值。     

二甲双胍对巨核细胞白血病细胞株Dami细胞增殖的抑制作用及其机制

目的：研究二甲双胍对巨核细胞白血病细胞株Dami细胞生长的影响,初步探讨二甲双胍抑制Dami细胞增殖的分子机制。方法：将培养的Dami细胞分为空白对照组,1、2、4、8、16和32 mmol?L-1二甲双胍处理组;MTT法检测不同浓度二甲双胍作用后Dami细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹分析Cdc2和Cyclin B1蛋白的表达以及Cdc2蛋白的磷酸化修饰。结果：MTT检测,与空白对照组比较,32 mmol/L二甲双胍处理组0、24、48、72和96 h Dami细胞增殖抑制率明显升高［（35.1±2.3）%、（49.7±5.1）%、（78.8±0.9）%、（79.1±3.0）%和（85.2±3.2）%］（P<0.01）;在二甲双胍处理72 h后,1、2、4、8、16和32 mmol/L处理组Dami细胞增殖抑制率分别为（33.8±1.3）%、（51.9±2.2）%、（59.4±1.6）%、（65.5±2.0）%、（75.5±0.9%）和（79.1±3.0）%,二甲双胍对Dami细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。流式细胞术检测,与空白对照组比较,1、2和4 mmol/L二甲双胍处理组G2/M期细胞比例从（26.0±0.5）%升高至（38.5±1.5）%、（48.4±1.1）%和（58.2±2.7）%,4 mmol?L-1二甲双胍处理组G2/M期细胞比例明显高于对照组（P<0.01）。免疫印迹分析,与空白对照组比较,4 mmol/L二甲双胍处理组Cdc2和Cyclin B1的表达水平明显下降,Cdc2在Try15位点磷酸化明显上调,而在Thr161位点的磷酸化明显下调。结论：二甲双胍能抑制Dami细胞增殖并诱导其发生G2/M期阻滞,其机制可能与Cdc2/Cyclin B1复合物的活化受到抑制有关。