RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p (视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy p (视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.     

负载紫红质通道蛋白2重组腺病毒的包装及功能鉴定

背景 紫红质通道蛋白2(ChR2)是从单细胞绿藻莱茵衣藻上分离的一种光敏感通道蛋白,可作为光刺激神经细胞的手段,与电、磁和超声波相比,光在时间和空间上对神经细胞的刺激将更精确. 目的 构建负载ChR2基因的重组腺病毒,并鉴定其功能.方法 将人胚肾293( HEK293)细胞在含质量分数10％胎牛血清的DF12培养基中进行培养及传代.腺病毒穿梭质粒pSB291-hCHR2-GFP与腺病毒包装质粒pBHGlox △E1,3 Cre共转染HEK293,包装得到少量负载ChR2基因的重组腺病毒(Ad-ChR2),经HEK293细胞扩增、CsCl梯度离心,Tris-HCl透析后得到纯化Ad-ChR2.获取4只出生1d的清洁级Long Evans大鼠视皮层组织,用组织块培养法利用无血清培养基原代培养视皮层细胞,用纯化的Ad-ChR2转染培养的视皮层细胞,当转染成功的视皮层细胞表达绿色荧光时给予460 nm蓝光刺激,应用膜片钳技术记录视皮层细胞的动作电位.结果 纯化浓缩后的Ad-ChR2滴度可达7.9×1010PFU/ml,HEK293细胞转染Ad-ChR2 24 h后倒置荧光显微镜下即可见细胞膜上有绿色荧光表达,转染13d可见细胞由扁平变为圆形.无血清培养的视皮层细胞转染纯化的Ad-ChR2后细胞膜上可见绿色荧光蛋白(GFP)的表达,460 nm蓝光刺激后用膜片钳技术可记录到蓝光诱发的视皮质细胞的动作电位.结论 本研究成功构建了负载ChR2基因的重组腺病毒表达载体,并证实ChR2能够感染有功能的视皮质细胞,这对视觉可塑性方面的研究非常重要.     

三种不同方法保存的兔角膜内皮细胞形态学观察

目的 通过观察兔角膜内皮细胞形态,了解不同保存方法和不同保存时期及时间点对角膜内皮细胞活性和密度的影响.方法 采用短期湿房4 ℃保存6 h、D-X角膜中期保存液4 ℃保存3 d、长期深低温保存3个月,取3组各自限定时间的保存角膜片进行检测,分别行角膜内皮细胞茜素红和台盼蓝活性染色、光学显微镜观察及图像分析.结果 长期深低温保存后的兔角膜内皮细胞活性率、细胞密度及六边形细胞率低于前两组,细胞面积高于前2组,均具有统计学差异.结论 正确掌握3种方法,维持角膜内皮细胞生物活性,虽然深低温保存方法对角膜内皮细胞活性和密度有一定影响,但其活性率在80%以上,仍在角膜移植手术可接受的范围内.     

医用组织黏合剂黏合兔眼巩膜穿通伤口与传统缝合的对比实验研究

目的 探讨a-氰基丙烯酸正辛酯为主体的医用化学组织黏合剂密闭兔眼巩膜全层裂伤的可能性.方法 45只成年兔建立经巩膜穿通伤模型,右眼用医用胶黏合,左眼缝线缝合,术后3、7、14、30、90天观察医用胶的降解,对比观察伤口组织病理学愈合情况.结果 医用胶能够迅速密闭巩膜伤口.术后各观察时间点,眼前、后节均未观察到炎症反应.电镜和光镜观察组织伤口均愈合.随巩膜伤口愈合,抗球内压力逐渐增加.医用化学组织黏合剂术后3个月分解吸收.结论 医用化学组织黏合剂可有效密闭巩膜穿通伤.     

临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术治疗眼球前、后节外伤的远期疗效

目的 评价临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术治疗眼球前、后节外伤的远期疗效.方法 对11例(11只眼)眼球前、后节外伤的男性患者,年龄7～46岁,其中,成人患者6例(6只眼),儿童患者5例(5只眼), 施行临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术.术后观察视网膜,角膜移植片,眼压,视力等.结果 随访4～68个月,平均24.6个月.随访期间,5例成人患者(5只眼,占45.5%) 的眼球得以保留.视力:1例为手动,2例分别为0.05,1例为0.08,1例为0.2 ;眼压:1例患者眼压25 mmHg, 用0.5%噻吗心胺眼液治疗,眼压控制在21 mmHg以下,其余4例患者眼压正常.6例患者(6只眼,占54.5%)眼球萎缩,其中, 5例年龄≤12岁的患儿伤眼都出现萎缩, 另1例成人患者因继发性青光眼,经巩膜的睫状体激光光凝治疗后眼球发生萎缩.结论 临时人工角膜下穿透性角膜移植联合玻璃体切除手术是治疗眼球前、后节外伤的安全和有效方法,眼部的损伤程度可能是影响伤眼预后的主要因素,儿童眼前、后节外伤后联合手术的预后不良.     

硫酸软骨素蛋白多糖对视皮层γ-氨基丁酸能神经元表达及其抑制性突触传递功能的影响

目的:通过体外观察硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)对γ-氨基丁酸(GABA)能神经元表达及其抑制性突触传递功能的影响,为探索CSPGs抑制视皮层可塑性的机制提供实验依据。方法:运用硫酸软骨素酶(ChABC)处理体外培养的胎鼠视皮层神经元,降解其CSPGs后应用免疫荧光显色检测CSPGs降解情况及GABA能神经元的表达变化,并用膜片钳检测其自发性微小性抑制性突触后电流(mIPSCs)以观察其抑制性突触传递功能变化情况。结果:0.1 U/ml ChABC处理神经元后,CSPGs被成功降解,GABA能神经元细胞密度、mIPSCs幅度和频率均显著低于正常对照组。结论:CSPGs能促进GABA能神经元表达及其抑制性突触传递功能的成熟,这可能是CSPGs抑制视皮层可塑性的作用机制之一。     

冻存复苏后大鼠视网膜干细胞的增生及分化特性

目的研究视网膜干细胞冻存复苏后的成活率及再培养后的增生分化特性。方法对胎龄17 d Long Evans的大鼠眼视网膜干细胞进行分离与体外培养。利用无血清培养基短期体外培养大鼠胚胎来源的视网膜干细胞，将传代三代后的视网膜干细胞以冻存液［体积分数为80%的改良基础培养基（DMEM）/F12，10%牛血清白蛋白（BSA），10%二甲基亚砜（DMSO），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/ml］于液氮中冻存，于1、2、4、8、12、16周分别复苏，计数活细胞比例进行再培养，并进一步诱导分化，采用免疫细胞荧光化学方法检测视网膜干细胞的增生及分化特性。结果不同的冻存时间对冻存后细胞存活率的影响无显著差异(P＞0.05)，再培养生长良好，具有视网膜干细胞特异性标志，并可进一步诱导分化为视网膜各种类型的细胞。结论大鼠视网膜干细胞的冻存复苏并不影响其原有的增生及分化特性。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 94-97)     

大鼠视觉发育可塑性关键期终止前后视皮层AMPA受体电流的发育变化

目的为了探索视觉发育可塑性关键期终止机制,对可塑性关键期终止前后,正常大鼠视皮层α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid,AMPA)受体介导的兴奋性突触后电流进行了研究。方法采用脑片膜片钳全细胞记录技术,记录生后3~8周正常大鼠视皮层AMPA受体介导的兴奋性突触后电流。结果在大鼠视皮层II-IV层,95例神经元形成全细胞记录,其中记录到AMPA受体电流43例;生后3~8周,视皮层神经元的输入阻抗、静息膜电位差异无统计学意义;生后3~8周,AMPA受体电流的潜伏期、上升时间、下降时间及半波宽差异无统计学意义;生后3~6周AMPA受体电流的幅值随发育逐渐增加,6~8周幅值变化不显著。结论视觉发育可塑性关键期高峰到成年阶段,大鼠视皮层神经元被动膜学特性无明显变化;AM-PA受体电流幅值随发育逐渐增加,关键期终止时达顶峰;突触后AMPA受体的功能变化可能参与了视觉发育可塑性关键期的终止过程。     

正常大鼠发育过程中视网膜电图a波的特点

目的观察正常大鼠发育过程中暗适应视网膜电图（ERG）a波的变化特点。方法实验研究。采用RETI-scan系统,环形角膜电极和不锈钢针状电极,对8组不同日龄大鼠（21、25、32、35、37、46、60及90d）记录不同刺激光强度下（0．03、0．95、3和9．5cd·S·m^-2）的暗适应ERG。导出数据,先采用Matlab7．4对数据进行预处理,然后根据数学模型使用Excel提供的规划求解模型拟合a波并分析模型中的2个参数：饱和波幅（Rmp3）与敏感度（S）。结果不同刺激光强度下Rmp3的最小值均出现在25日龄大鼠,光强为0．03cd·S·m^-2时其最大值出现在60日龄大鼠,余则出现在46日龄大鼠。8组大鼠的S均与刺激光强度呈线性关系（S=ks·Ⅰ＋bs）,除60日龄大鼠外,曲线的斜率ks基本保持不变,约为0．09,日龄主要影响常量bs。结论正常大鼠ERGa波的饱和波幅及敏感度均不同程度地受日龄的影响。