淫羊藿苷对大鼠血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:研究淫羊藿苷(Icariin)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的抑制作用。方法:组织贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs,取5-8代细胞分为对照组、钙化模型组和淫羊藿苷干预A、B、C组。对照组用DMEM培养基培养;钙化模型组用含10mmol/Lβ-甘油磷酸盐(β-GP)的DMEM培养基培养;干预A、B、C组均以钙化模型组为基础分别与10-6 mol/L、10-5 mol/L和10-4 mol/L Icariin的DMEM培养基共培养,茜素红-S染色法鉴定各组细胞钙化情况,硝基苯酚法测定各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR检测各组细胞内骨保护素(OPG)和核因子κB(NF-κB)受体活化因子配体(RANKL)的mRNA水平,用Western blotting检测各组细胞OPG和RANKL的蛋白表达。结果:与对照组比较,钙化模型组VSMCs发生细胞钙化,并形成红色结节,ALP活性显著升高(P0.01),OPG、RANKL mRNA和蛋白表达均增加(P0.01);与钙化模型组比较,干预A、B、C组细胞钙化减少,ALP活性减低(P0.01),OPG、RANKL mRNA和蛋白表达均下调(P0.01),尤以干预B组效果最显著。结论:淫羊藿苷可能通过降低ALP活性及OPG、RANKL表达来抑制动脉钙化。     

人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立

目的利用β-甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞（human vascular smooth muscle cells,HVSMCs）制备体外血管钙化模型。方法用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体α-sm-actin染色鉴定,将传4～6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常DMEM培养基培养,钙化组加入10mmol/Lβ-甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10d。茜素红S染色及碱性磷酸酶法鉴定。结果：分离的原代细胞经S-P染色鉴定为阳性,呈淡黄色。钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点（4,6,8,10d）都有所增加（P〈0.01）。结论：β-甘油磷酸盐体外能够诱导HVSMC钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型。     

血管平滑肌细胞钙化过程中DNA损伤响应分子p21、p53和c-abl的变化

目的研究钙化发生过程中细胞DNA损伤响应分子表达水平的变化。方法半定量方法测定钙化细胞中p21、p53、c-abl的mRNA水平,通过免疫印迹法检测p53和chk1磷酸化水平。结果血管平滑肌细胞在10 mmolβ-磷酸甘油酯的诱导下,随着时间的延长,在时间点24,,6 d时,p21、p53、c-abl的mRNA水平上升,第8天后mRNA水平下降。在前6 d中,p53和chk1磷酸化呈逐步上升趋势。结论在钙化过程的前期,p21、p53、c-abl的mRNA水平上升,p53和chk1磷酸化水平也呈上升趋势,这表明钙化的发生和DNA损伤响应分子有关。