双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素2(hBD-2)mRNA的表达

目的 :检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞 β 防御素 2基因的激活作用及其活性组分。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法和Northern杂交检测HT 2 9细胞hBD 2mRNA的表达 ;采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取等方法分离双歧杆菌胞壁蛋白质成份。结果 :RT PCR和Northern杂交分析显示 ,在正常培养条件下HT 2 9细胞无可见的hBD 2mRNA表达信号 ,但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD 2mRNA表达。结论双歧杆菌能诱导人肠腺上皮细胞hBD 2基因的表达 ,双歧杆菌胞壁蛋白可能是其诱导作用的活性组分。双…     

RT-PCR法检测HNP1基因在气管上皮细胞转染后的表达

采用脂质体转染法将人中性粒细胞防御素（ Ｈ Ｎ Ｐ１ ）的 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 重组真核表达质粒ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１导入无血清培养的人和兔的气管粘膜上皮细胞,利用逆转录聚合酶链反应（ Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ）法,在核酸水平检测 Ｈ Ｎ Ｐ１ 在气管上皮细胞的表达。结果：在人和兔的转染上皮细胞中均可检测到 Ｈ Ｎ Ｐ１ｍ Ｒ Ｎ Ａ 的表达,而在未转染的上皮细胞中 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ检测结果呈阴性。这一结果与作者先前用免疫组化法在蛋白质水平上检测的结果一致,并证明ｐ Ｂａｂｅ Ｎｅｏ Ｈ Ｎ Ｐ１ 转染至气管粘膜上皮细胞后能得到有效表达。     

大鼠β-防御素rBD-1cDNA克隆

为开展β－防御素基因表达调控分子机制及其转基因防治粘膜感染的研究,作者克隆了大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ ｃＤＮＡ。从大鼠肾脏组织提取ＲＮＡ,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ,并重组到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ 载体,经限制性内切酶谱分析和ＤＮＡ序列测定,证实所克隆的ｃＤＮＡ片段为大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ ｃＤＮＡ。     

纳米药物载体在医药领域中的研究进展

纳米本身是个长度单位,1nm等于10^-9m,纳米颗粒的粒径比毛细血管通路还要小12个数量级。当一种物质被不断切割至一定程度,其粒子小至纳米量级即为纳米材料。纳米材料往往会产生一些新的理化特性,正是这些特有的特性,使其在药物和基因输送方面有许多优越性：①许多半衰期短的药物可能需要每天重复给药多次,制备成缓释药物后,将极大延长药物作用时问②能解决口服易水解药物的给药途径问题,大大降低药物与胃蛋白酶等消化酶接触的机会③可进行靶向给药：纳米载体经特殊加工后可达到靶向输送的目的,更加准确地对准组织或器官,减少药物对人体的不良反应④载药纳米粒可以改变膜转运机制,增加药物对生物膜的透过性,有利于药物透皮吸收与细胞内药物发挥⑤可在保证药物作用的前提下,减少给药剂量,减少药物的副作用⑥可消除特殊生物屏障对药物作用的阻碍⑦能携带多种化学药物⑧载体及其生物学降解产物易被消除。     

人β防御素-2与前列腺癌特异性膜抗原嵌合蛋白真核表达质粒构建及其诱导的小鼠特异性免疫应答

探索人β防御素2 (h BD- 2 )和前列腺特异性膜抗原(PSMA)共表达重组核酸疫苗针对前列腺癌的免疫治疗。研究以pc DNA3.1为载体,构建重组质粒pc DNA3.1/PSMA和pc DNA3.1/h BD- 2 - PSMA,通过RT- PCR和免疫组化检测其表达。免疫小鼠后,进行血清中抗体检测,CD4 、CD8 T淋巴细胞数目测定及CTL 特异性杀伤作用检测。结果显示构建的质粒转染COS- 7细胞后能表达目的基因,免疫小鼠后能在体内持久表达,可以诱导产生特异性抗体,能有效的刺激T细胞增生,诱导特异性CTL 反应。当以h BD- 2作为免疫佐剂时,CTL 活性更强。本研究成功的构建了含PSMA的表达质粒,免疫小鼠可以诱导出有效的体液和细胞免疫,为前列腺癌的免疫治疗奠定了一定的实验基础     

PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究

目的 :用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL 39基因突变体 ,并比较研究FALL 39及其突变肽的功能。方法 :采用PCR体外定点突变技术 (PCR SDM ) ,设计一对方向相反的引物 ,其中一个引物引入一个突变点 ,应用高保真的PolybestDNA多聚酶进行含FALL 39肽的PGEXλ1T质粒的PCR扩增 ,使FALL 39第 2 2位密码子由CAG突变为AAG ,将扩增片段自身连接后克隆入工程菌JM1 0 9中使其表达其突变肽 (FALL 39 lys2 2 ) ,纯化后与FALL 39进行抗菌活性比较。结果 :DNA测序结果表明在预期位点发生突变 ,突变后FALL 39 lys2 2抗菌活性…     

大鼠β-防御素rBD-1基因在皮肤和肾脏固有表达

设计大鼠β－防御素ｒＢＤ－１ｃＤＮＡ序列一对特异引物：Ｒ１５′→３′ＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＣＡＣＣＧ;Ｒ２５′→３′ＣＣＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＣＣ。根据大鼠β－ａｃｔｉｎｃＤＮＡ序列设计一对阳性对照特异引物：Ｂ１５′→３′ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧ;Ｂ２５′→３′ＧＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧ。引物由Ｇｉｂｃｏ公司合成。从Ｗｉｓｔａｒ大鼠皮肤、肾脏、气管、子宫颈、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、骨髓及腮腺组织中提取总ＲＮＡ,行ＲＴ－ＰＣＲ扩增…     

重组人β-防御素-2基因的植物表达载体的建立

目的：运用植物转基因技术，探索构建表达人类β-防御素-2(hBD-2)的植物生物反应器的可能性及技术路线。方法：将C端带myc和6xHis双标记的重组hBD-2基因插入植物真核表达载体pCAMBIA1304中，构建C端带myc和6xHis双标记的重组hBD-2植物真核表达载体rpCAMBIAl304／hBD-2／His。利用此载体转化根癌农杆菌LBA4404，经卡那霉素进行抗性基因筛选和PCR检测，确定根癌农杆菌的阳性克隆。重组hBD-2通过转化阳性的根癌农杆菌被导入小麦幼胚愈伤组织细胞，经潮霉素进行抗性基因筛选，获得抗性愈伤组织。结果：酶切分析、PCR验证和DNA测序等证据表明：C端带myc和6xHis双标记的重组hBD-2已被正确地插入pCAMBIAl304载体中，并位于CaMV35S与Nos终止子之间，提示重组hBD-2／His基因的植物表达载体rpCAMBIA1304／hBD-2／His已被成功构建。卡那霉素抗性基因筛选和PCR检测显示：rpCAMBIAl304／hBD-2／His已成功转化根癌农杆菌LBA4404，阳性克隆菌株已获得。潮霉素抗性筛选结果提示：hBD-2基因被导入小麦幼胚愈伤组织细胞。结论：本研究为进一步培育hBD-2遗传表达植株奠定了基础。     

小鼠小肠抗生素肽的初步分离

目的 初步分离小鼠小肠抗生素肽.方法 将12只健康ICK小鼠剖腹切取从屈氏韧带到回盲部的小肠,以10%乙酸溶液冲洗肠腔收集灌洗液,并以30%乙酸溶液制备小肠组织匀浆,反复离心,聚乙二醇浓缩后透析,冰冻干燥,进行AU-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、考马斯亮蓝R-250染色或银染显示多肽条带,然后进行凝胶成像分析和杀菌试验.结果 小鼠小肠组织匀浆和灌洗液中均含有可杀灭细菌、真菌的抗生素多肤,其中组织匀浆中所含的此类多肽较多;小鼠小肠抗生素肽的杀菌作用具有剂量依赖关系,且对不同细菌、真菌的杀灭作用也不同;小鼠小肠抗生素肽的分子量主要集中于3.0kD～14.3kD和29.0kD.结论 小鼠小肠含有多种抗生素肽,具有广谱的杀灭微生物的作用.     

HMGN2分子体外抗乙型肝炎病毒活性研究

目的： 我们先前的研究证明HMGN2（high mobility group nucleosomal-binding domain 2）是人LAK细胞抗菌的一个新的效应分子,本研究欲检测其体外抗乙型肝炎病毒的活性。方法: 应用反向高效液相色谱技术从人淋巴结组织酸溶性提取物中分离纯化批量HMGN2分子,用质谱精确分子量测定、Western blotting和抗菌试验对分离纯化得到的HMGN2分子进行分子鉴定。采用MTT法检测HMGN2分子对稳定转染复制型HBV重组质粒的肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的细胞毒性;用不同浓度HMGN2分子作用于HepG2.2.15细胞,分别在第3 d和第6 d收集细胞培养上清液,ELISA检测上清中HBV表面抗原（HBsAg）及e抗原（HBeAg）,采用实时荧光定量PCR法检测上清液HBV DNA的含量。结果: 从人淋巴结组织中分离纯化获得纯度较高的HMGN2蛋白;在检1-100 mg/L范围内,HMGN2分子对HepG2.2.15细胞无细胞毒性;HMGN2分子在1-5 mg/L水平即可显著抑制HBeAg和HBsAg的表达,可显著降低HBV DNA拷贝数。结论: HMGN2分子在体外具有较强的抗HBV活性。