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1.
5′端帽状结构对多数病毒RNA的稳定性和感染性具有重要作用,而对另一些病毒的RNA则非必需〔1~3〕。乙脑病毒基因组为单股正链RNA,长约11kb,5′端有帽状结构,3′端无PolyA〔4,5〕。为了验证5′mGpppA对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用,我们采用本室构建的乙脑病毒感染性克隆(乙脑病毒全长cDNA,克隆于T7启动子下游)体外转录出感染性RNA(即感染性转录体),对在转录反应中掺入与不掺入5′mGpppA所获得的RNA,在转染BHK细胞后的病变效应及免疫荧光强弱是否相同,确定5′…  相似文献   
2.
目的:表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人.鼠嵌舍抗体。方法:用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因,克隆人IgG1恒定区基因组基因,构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL,pcDNA3、1H,共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞,用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达,MTX加压筛选表达量高的克隆,扩大培养收集上清并纯化,纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论:在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。  相似文献   
3.
目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础  相似文献   
4.
本文作者采用聚合酶链式反应(PCR),从HIV-1cDNA克隆BH10中扩增出Pr42gag的基因片段,经适当的限制性内切酶消化后插入到杆状病毒转移载体pBacPAK9中,使其处于多角蛋白启动子的控制之下,构成重组转移载体pBacGAG42。酶切鉴定结果与预期的一致。再用载体上多克隆位点两翼的引物对连接处进行序列分析,结果表明外源基因处于多角蛋白启动子的控制下,且成功地引入了起始码和终止码。  相似文献   
5.
基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 在CHO细胞中表达基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,并对其活性进行分析。方法以质粒pcDNA5 /FRT为骨架 ,应用pCI dhfr1(本室构建并保存 )的dhfr基因和hCMV启动子及SV4 0polyA ,构建了含有共扩增基因的哺乳动物双启动子表达载体 ,RT PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因 ,与人IgG1轻重链恒定区基因融合后亚克隆到表达载体pA的多克隆位点 ,构建了表达质粒pA HL ,脂质体转染CHO(dhfr )细胞 ,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高MTX的浓度 ,筛选表达量高的克隆 ,扩大培养、收集上清 ,并纯化 ,纯化的嵌合抗体进行SDS PAGE、Western印迹、抗原结合活性和微量细胞中和实验。结果 在MTX的浓度为 2× 10 -7mol/L时 ,获得稳定表达细胞株 ,表达量为 5mg/L。结论 成功地在CHO(dhfr )细胞表达了具有中和活性的基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。  相似文献   
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