5′端帽状结构对乙脑病毒RNA稳定性和感染性的作用

５′端帽状结构对多数病毒ＲＮＡ的稳定性和感染性具有重要作用,而对另一些病毒的ＲＮＡ则非必需〔１～３〕。乙脑病毒基因组为单股正链ＲＮＡ,长约１１ｋｂ,５′端有帽状结构,３′端无ＰｏｌｙＡ〔４,５〕。为了验证５′ｍＧｐｐｐＡ对乙脑病毒ＲＮＡ稳定性和感染性的作用,我们采用本室构建的乙脑病毒感染性克隆（乙脑病毒全长ｃＤＮＡ,克隆于Ｔ７启动子下游）体外转录出感染性ＲＮＡ（即感染性转录体）,对在转录反应中掺入与不掺入５′ｍＧｐｐｐＡ所获得的ＲＮＡ,在转染ＢＨＫ细胞后的病变效应及免疫荧光强弱是否相同,确定５′…     

抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的：表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人．鼠嵌舍抗体。方法：用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因，克隆人IgG1恒定区基因组基因，构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL，pcDNA3、1H，共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达，MTX加压筛选表达量高的克隆，扩大培养收集上清并纯化，纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论：在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体，为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体的研究

目的:构建含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体。方法:首先克隆FRT序列与HBsAg的融合基因FRT-HBsAg,然后将FRT-HBsAg亚克隆到pCI neo的MCS中,构建表达载体pCI FRT-HBsAg。以此载体转染CHO/dhfr-细胞,用1g/L的G418筛选抗性克隆。检测抗性克隆HBsAg的表达,筛选表达量高的克隆作为宿主细胞株,命名为CHO/dhfr-FRT+。将表达质粒pA FRTHFLF和pOG44以1∶9的质量比混合,取2μg转染CHO/dhfr-FRT+。转染48h后,换选择培养基(撤掉H、T)用96孔板进行克隆化,2wk后对长成的单克隆进行检测。筛选正确整合到CHO/dhfr-FRT+细胞中FRT位点的克隆,并不断提高MTX的浓度,进一步筛选表达量更高的克隆。在MTX的浓度为2×10-7mol/L时,获得稳定表达细胞株,其最后的表达量为5mg/L。对此细胞株扩大培养后,收集上清并纯化,以纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE及Westernblot和抗原结合活性的检测。结果:构建了高转录活性位点整合FRT序列的CHO/dhfr-细胞株,并在此细胞株中表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,表达量为5mg/L。结论:构建了含有FRT序列的CHO/dhfr-工程细胞株,并在此细胞株中用定点整合系统表达抗基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体,为用此系统表达抗体分子和其他蛋白分子奠定了基础     

编码HIV-1 Pr42~(gag)的杆状病毒转移载体的构建及鉴定

本文作者采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ），从ＨＩＶ－１ｃＤＮＡ克隆ＢＨ１０中扩增出Ｐｒ４２ｇａｇ的基因片段，经适当的限制性内切酶消化后插入到杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ９中，使其处于多角蛋白启动子的控制之下，构成重组转移载体ｐＢａｃＧＡＧ４２。酶切鉴定结果与预期的一致。再用载体上多克隆位点两翼的引物对连接处进行序列分析，结果表明外源基因处于多角蛋白启动子的控制下，且成功地引入了起始码和终止码。     

基孔肯亚病毒人鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的　在CHO细胞中表达基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,并对其活性进行分析。方法以质粒pcDNA5 /FRT为骨架 ,应用pCI dhfr1(本室构建并保存 )的dhfr基因和hCMV启动子及SV4 0polyA ,构建了含有共扩增基因的哺乳动物双启动子表达载体 ,RT PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻重链可变区基因 ,与人IgG1轻重链恒定区基因融合后亚克隆到表达载体pA的多克隆位点 ,构建了表达质粒pA HL ,脂质体转染CHO(dhfr )细胞 ,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高MTX的浓度 ,筛选表达量高的克隆 ,扩大培养、收集上清 ,并纯化 ,纯化的嵌合抗体进行SDS PAGE、Western印迹、抗原结合活性和微量细胞中和实验。结果　在MTX的浓度为 2× 10 -7mol/L时 ,获得稳定表达细胞株 ,表达量为 5mg/L。结论　成功地在CHO(dhfr )细胞表达了具有中和活性的基孔肯亚病毒人 鼠嵌合抗体 ,为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。