内源性MGF在IGF-Ⅰ Pre-mRNA选择性剪接中的作用

目的 利用CRISPR/Cas9敲除小鼠成肌细胞系C2C12机械生长因子(mechano-growth factors,MGF),研究MGF在IGF-Ⅰ pre-mRNA选择性剪接和C2C12增殖分化中的作用.方法 针对IGF-Ⅰ第五个外显子设计并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒,通过细胞转染并筛选出MGF发生移码突变的细胞株.采用RT-qPCR技术,检测这些细胞株MGF和IGF-IEa表达变化,以及细胞增殖和肌向诱导分化能力的变化.结果 成功构建了针对MGF的CRISPR/Cas9基因敲除质粒,并筛选出3株MGF移码突变细胞株.这些细胞株的MGF和IGF-IEa表达上升,细胞增殖活性减弱,在诱导分化过程中,肌细胞标志性基因myogenin、MGF和IGF-IEa表达升高.结论 内源性MGF敲除能够影响IGF-Ⅰ pre-mRNA的选择性剪接以及增殖分化能力.     

乳腺癌细胞特异性MGA启动子的扩增及功能分析

目的 探讨人乳腺球蛋白（mammaglobin A, MGA）基因启动子的乳腺肿瘤细胞特异性和调控元件,并验证MGA启动子载体系统在活体肿瘤组织中的表达活性。方法 PCR扩增5.6 kb大小的人MGA启动子片段,并在此基础上构建四个含有萤火虫荧光素酶报告基因的重组载体;瞬时转染到乳腺癌细胞系T47D和人胚肾细胞系HEK293T后,利用双荧光素酶报告基因体系,检测各个MGA启动子活性;稳定转染MGA重组载体到乳腺癌细胞系T47D（T47DEM）,进行裸鼠皮下造瘤,活体成像检测报告基因活性。结果 （1）双增强子的启动子活性低于单增强子启动子（降低82%）;（2）定点删除YY1结合元件后,启动子活性下降76.2%,乳腺肿瘤细胞特异性下降38.4%;（3）定点删除Nkx2.5后,启动子活性没有明显变化,但特异性降低31.9%;（4）细胞株T47DEM在体形成肿瘤后,表现出明显的报告基因活性。结论 研究了两个增强子叠加和两个转录因子结合位点（YY1和Nkx2.5）对MGA启动子活性和特异性的影响;构建的细胞株（T47DEM）可以用于治疗乳腺癌药物的在体筛选。