人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化毕赤酵母中的表达

目的在糖基工程化毕赤酵母中表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白（tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc）,考察糖基工程化过程对其活性的影响。方法将编码TNFR-Fc的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA中,构建重组表达质粒pPIC6-TF。用表达质粒转染N-糖基化工程改造的毕赤酵母菌株GSB,在含有杀稻瘟菌素的YPD平板上进行筛选。然后再使用HRP标记的羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行斑点印迹（dot-blot）筛选。选择表达量较高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57进行高密度培养,通过Protein A亲和层析从发酵上清中纯化融合蛋白,利用鼠L929细胞对融合蛋白的抗TNFα活性进行分析。结果通过筛选获得了表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达菌株,纯化后的TNFR-Fc融合蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型毕赤酵母表达产物,而低于哺乳动物细胞的表达产物。结论糖基化改造改善了人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的抗TNFα活性,但必须进行进一步的改造才可能获得与哺乳动物细胞表达产物相似的活性。     

分泌型毕赤酵母人全长抗体库的构建与鉴定

目的基于N-糖基化部分改造毕赤酵母构建表达分泌型人全长抗体库。方法基于酵母分泌型表达载体pPICZαA构建双启动子串联表达重链和轻链恒定区基因的载体pPICZαA-C H-C L,经基因序列分析和Western blot分析验证。设计44对简并引物经逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增获得轻链可变区V L和重链可变区V H基因库。通过PCR将其插入上述恒定区表达载体构建全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L。将该库电转化N-糖基化部分改造后宿主菌株GS115Y。随机挑取20个平板克隆进行菌液PCR鉴定、基因分析,并提交IgBLAST-imgt数据库鉴定抗体库正确性与多样性。结果获得表达重链和轻链恒定区的表达载体pPICZαA-C H-C L,并在此基础上初步获得全长抗体表达库pPICZαA-V H-C H-V L-C L,库容量为105。结论成功构建了分泌型N-糖基化毕赤酵母人全长抗体库。     

人GPC3基因真核表达载体的构建及重组蛋白表达纯化

目的:人磷脂酰肌醇蛋白3是肝癌的诊断标志物和潜在治疗靶点。本研究目的在于获得足量的GPC3蛋白用于结构、功能及应用研究。方法:通过RT-PCR从人胎肝中克隆GPC3编码cDNA,利用Xho I和Xba I酶切位点,将GPC3ORF编码基因插入毕赤酵母表达载体pPICZ A中,构建真核表达质粒pPICZ A-GPC3。以该表达质粒转染毕赤酵母菌株GS115,在含有Zeocin的YPD平板上进行筛选。然后使用HRP标记的山羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行Dot blot筛选。对筛选获得的菌株进行诱导表达,表达上清经SDS-PAGE和Western blot检测。结果:筛选获得的阳性菌株诱导表达上清SDS-PAGE结果表明在预期位置观察到GPC3重组蛋白条带,且该蛋白条带与抗GPC3单克隆抗体(mAb)孵育后呈现特异性反应。工程菌株经高密度培养后,发酵上清中重组GPC3表达量约5 mg/L,进而通过阳离子交换层析从发酵上清中纯化了重组蛋白。结论:利用毕赤酵母表达并纯化了重组人GPC3蛋白,为进一步研究GPC3的结构和功能奠定了基础。