siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

目的构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用。方法应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化。Annexin V法检测细胞凋亡。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。结果构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS。获得了稳定转染的细胞系。与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓。MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少。MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P<0.01)。1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P<0.01)。结论特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。     

siRNA对骨肉瘤细胞细胞周期及survivin表达的影响

目的 构建人survivin特异性siRNA,探讨其对骨肉瘤细胞MG63细胞周期及survivin表达的影响.方法 构建survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系,以Western blot法检测survivin蛋白表达变化,透射电镜、Hoechst染色检测细胞凋亡情况,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体PsiS,获得了稳定转染的细胞系.与正常MG63细胞、阴性对照细胞相比,MG63/PsiS细胞中survivin蛋白表达减少,部分细胞核致密浓染或碎块状浓染,凋亡率增加了7倍,而G2/M期细胞减少近50%.结论 特异性siRNA能够明显抑制survivin基因在MG63细胞中的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.     

基因治疗成骨肉瘤的探索：人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法.方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1( )中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147.用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降.结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAas CD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础.     

应用RNA干扰技术抑制骨肉瘤细胞中基质金属蛋白酶-1基因表达的研究

目的构建针对人基质金属蛋白酶-1（MMP-1）基因的特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体，并观察其在人骨肉瘤细胞MG63中对MMP-1基因表达的抑制作用。方法培养骨肉瘤细胞MG63，根据MMP-1基因cDNA编码序列，设计并合成针对MMP-1基因的特异性RNA干扰片断，将其克隆入pSilencer 3．0-H1 neo质粒，构建MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。与阴性对照质粒分别转染MG63细胞，G418筛选稳定转染的细胞系。采用RT—PCR、Western blot检测MMP-1 mRNA和蛋白的表达水平，同时进行体外侵袭试验。结果成功构建了MMP-1基因shRNA真核表达载体siRNA MMP-1。获得了稳定转染siRNA MMP-1载体和阴性对照载体siRNA neg的细胞系，并发现MG63／siRNA MMP-1细胞MMP-1 mRNA和蛋白表达均受到明显抑制，细胞侵袭能力也显著下降。结论特异性shRNA能够明显抑制MMP-1基因在MG63细胞中的表达，这为进一步研究MMP-1在MG63细胞中的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

表没食子儿茶素-3-没食子酸酯抑制骨肉瘤细胞增殖及其机制

目的：研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3 gallate,EGCG）对人骨肉瘤细胞增殖的影响及机制。方法：培养骨肉瘤细胞SOSP9607,加入EGCG制作细胞生长曲线;EGCG作用于人骨肉瘤SOSP9607细胞株,Hoechst染色检测细胞凋亡。RT-PCR及Western印迹法研究survivin的mRNA及蛋白表达的变化。结果：EGCG可明显抑制SOSP9607细胞的增殖,60μg/mL EGCG作用48h后,细胞出现明显的凋亡,凋亡率达到16.3%。同时骨肉瘤细胞中survivin mRNA和蛋白表达减少。结论：EGCG可抑制乳腺癌细胞的增殖,这可能与EGCG抑制了survivin表达有关。     

预变性神经移植促进神经再生的动物实验

背景许多研究均认为预变性神经移植优于新鲜神经移植.目的通过兔腓总神经不同时限预变性神经移植,从组织学、免疫组织细胞化学、电生理、超微结构等多方面观察预变性对神经功能恢复的影响.设计分组对照实验.单位解放军第四军医大学唐都医院全军骨科中心,解放军第四军医大学西京医院骨科.材料成年家兔42只,体质量2.3～2.6 kg,雌雄不拘. 方法实验于1996年于第四军医大学西京医院全军骨科中心完成.家兔42只分为A,B,C,D,E,F,G7组,A,B,C,D,E,F组分别为预变性0,4,7,14,21,28 d,B,C,D,E,F组切断腓总神经;A组动物切开皮肤,暴露但不切断神经.G组只切段右侧腓总神经.B,C,D,E,F组分别于术后4,7,14,21和28 d重新暴露已切断的神经,取远段1.5 cm变性神经段移植修复对侧神经,双侧交叉移植.A组2周后重新暴露腓总神经,同法切取1.5 cm神经段左右交叉移植.G组2周后将右侧预变性神经段移植到左侧新鲜受体床,左侧新鲜神经段移植到右侧预变性受体床.主要观察指标①神经再生起初延迟期及生长速度.②神经-肌肉传导速度.③组织学观察、计数轴突通过率.结果①D组2周预变性神经移植与新鲜神经移植相比可显著降低轴突再生起初延迟期(由3.04降至0.04 d);提高神经生长速度(由1.73～2.59mm/d);电生理示D,C,B组神经-肌肉传导速度最快,其次是A和E组,F组最慢;D组轴突通过率与C组比较无明显差异.②术后6周D组动物大量成熟髓鞘出现,C组动物中等量髓鞘出现,A,B,E及F组偶见髓鞘.结论预变性神经移植在降低轴突再生起初延迟期、促进轴突再生速度、增强轴突通过率、提高神经-肌肉传导速度方面优于新鲜神经移植.预变性2周神经移植质量最佳,其次是预变性1周神经移植,预变性4 d和3周也有增强神经再生的作用.     

后路经皮椎弓根螺钉内固定联合前路病灶清除植骨融合术治疗胸腰椎结核脊柱后凸畸形

目的：探讨后路经皮椎弓根螺钉内固定联合前路病灶清除植骨融合术治疗胸腰椎结核脊柱后凸畸形的临床疗效和安全性.方法：2010年2月至2011年7月,采用后路经皮椎弓根螺钉内固定联合前路病灶清除植骨融合术治疗胸腰椎结核脊柱后凸畸形患者23例,男15例,女8例.年龄26 ～67岁,中位数54岁.胸椎结核4例,腰椎结核14例,胸腰椎结核5例.所有患者均有不同程度的胸、腰背部疼痛和胸、腰椎后凸畸形.部分患者伴有乏力、纳差、低热、盗汗等结核中毒症状.所有患者均行X线、CT及MRI检查明确诊断.影像学资料显示椎间隙变窄或消失,病变椎体骨质破坏、椎体塌陷或死骨形成,椎旁脓肿形成,脊柱后凸畸形.单侧椎旁脓肿5例,双侧椎旁脓肿18例.脊髓损伤按Frankle分级,C级1例,D级4例.术后随访观察结核控制、脊髓神经功能恢复、疼痛缓解、脊柱后凸畸形矫正、脊柱功能恢复及并发症发生情况.结果：手术失血量220～950 mL,中位数360 mL.手术时间120～200 min,中位数150 min.切口均甲级愈合.所有患者均获得随访,随访时间6～24个月,中位数10个月.结核症状均缓解或消失.1例术后出现患侧胸腔积液和少量积气,经重新放置胸腔引流管后好转.5例脊髓损伤患者均恢复至Fran-kleE级.术后及末次随访时Oswestry功能障碍指数由术前69.33±18.46降至13.16±7.22、12.35±6.98;疼痛视觉模拟评分由术前（6.40±1.10）分降至（1.60±1.70）分、（1.20±1.20）分;后凸畸形Cobb角由术前15.08°±2.50°降至3.05°±0.80°、3.12°±0.60°.影像学检查证实植骨块位置均良好,均达到良好的骨性融合,椎间高度均无明显丢失.均无内固定物松动、断裂、移位等并发症发生;无结核复发.结论：采用后路经皮椎弓根螺钉内固定联合前路病灶清除植骨融合术治疗胸腰椎结核脊柱后凸畸形,创伤小,出血少,并发症少,可有效控制结核症状,缓解腰背部疼痛,矫正脊柱后凸畸形,恢复脊柱的稳定性,值得临床推广应用.     

人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区的克隆和序列测定

目的克隆人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区并进行序列测定.方法以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用RT-PCR方法得到人CD147的编码区cDNA,克隆至载体pcDNA3.1( )中,酶切鉴定后进行序列分析.结果获得人CD147编码区基因和重组质粒pcDNA3.1( )/asCD147,DNA序列分析证实获得了CD147基因,其序列和文献报道一致.结论采用基因克隆的方法得到人CD147基因,证明了CD147在成骨肉瘤细胞中也有表达,为进一步进行其结构和功能研究打下了基础.     

Coflex系统植入术及全椎板减压植骨融合内固定术治疗退行性腰椎管狭窄症的短期疗效对比观察

[目的]对比Coflex系统植入与全椎板减压植骨融合、椎弓根螺钉内固定术治疗退行性腰椎管狭窄症的短期疗效。[方法]抽取连续的30例住院治疗的退行性腰椎管狭窄症患者,随机分为两组,每组15例,分别施行Coflex系统植入和全椎板减压植骨融合椎弓根螺钉内固定术,观察比较两组的手术时间、出血量、术后住院时间、术前和术后6个月JOA评分,术后改善率及并发症情况。[结果]与传统减压融合术相比,Coflex组术后6个月JOA评分及术后改善率无明显差异,而手术时间、出血量及住院时间显著降低。随访期间Coflex组无1例发生术后并发症。[结论]Coflex植入系统是一种安全、有效、微创的治疗退行性腰椎管狭窄症的新术式,具有较好的临床应用前景。     

CD147结构和功能及其与肿瘤关系的研究进展

肿瘤侵袭和转移是多步骤过程的结果，其中包括基底膜降解、基质渗透以及肿瘤细胞进出血管和对靶组织的侵袭。所有这些都要求由蛋白水解酶介导的基底膜组成成分和细胞外基质大分子的重塑。在这些水解酶中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)由于其广泛的底物谱而尤其重要。活体观察显示在大多数恶性肿瘤中MMPs主要来源于间质细胞，尤其是成纤维细胞。成纤维细胞平时仅产生极少量的MMPs，但肿瘤细胞的存在可刺激成纤维细胞产生大量的MMPs。