缢蛏泛变应原原肌球蛋白的克隆表达、纯化及其免疫学特性研究

原肌球蛋白（tropomyosin）作为泛变应原广泛存在于无脊椎动物体内，本研究从缢蛏中克隆出一个原肌球蛋白基因。缢蛏（Sinonvacula constricta）购于深圳市水产品市场。9个缢蛏过敏病人的阳性血清来自深圳市人民医院和儿童医院（经Unit CAP 检测，2级以上）。缢蛏原肌球蛋白 cDNA片段转入表达载体（pET-28a），引物序列P5：5＇-GGACATATG-GAGGCCATCAGTTGGC-3；p3：5＇-CCGGAAT-TCTTAGCCAGTCAGTTKCGC-3＇。重组原肌球蛋白基因表达按常规方法进行。目标蛋白洗脱组分透析并保存。纯化缢蛏重组原肌球蛋白进行SDS-PAGE，电转到纤维素膜上，再经常规免疫学方法鉴定。重组原肌球蛋白分离后进行酶切，混合肽进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定。     

前处理方法及冻融次数对尿液蛋白标志物质量影响的探究

目的探究不同前处理方法及冻融次数对尿液样本蛋白质量的影响。方法取样后的尿液样本经过离心与不离心处理后,分别于室温及4 ℃冷藏放置4、12、24、48、72 h,及在-80 ℃反复冻融1、3、5、10次后,经过桥式酶联免疫吸附测定方法检测丛生蛋白、肾损伤分子 1、胱抑素C及视黄醇结合蛋白4种蛋白的质量浓度变化。结果经离心处理的样本,在室温或4 ℃冷藏放置48 h后,丛生蛋白质量浓度显著降低。未经离心处理的样本,室温放置24 h后,丛生蛋白质量浓度显著降低;4 ℃冷藏条件下蛋白相对稳定,在放置72 h后显著降低。4种蛋白-80 ℃反复冻融1、3、5、10次后,质量浓度均无显著变化;未经离心处理样本,蛋白质量浓度较离心处理样本高。结论在冷冻保存前,尽量将尿液样本先放置在4 ℃环境下处理或暂存,且暂存时间不超过72 h;若室温放置,时间不超过24 h;且根据研究用途决定是否离心。样本反复冻融10次对尿液蛋白质量无明显影响,可以根据检测需求及实际条件,确定样本是否分装及分装管数等。     

枝孢芽枝菌主要过敏原的分析与免疫、质谱鉴定

目的分析并用免疫和质谱方法鉴定枝孢芽枝菌(Cladosporium cladosporioides)的主要过敏原。方法空气中暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,经鉴定后大规模培养;用碳酸盐缓冲液提取枝孢芽枝菌蛋白,并用SDS-PAGE、Western-blotting方法鉴定出枝孢芽枝菌的主要过敏原。主要过敏原胶内酶切,再经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,所得质谱数据进入网站(http://www.matrixscience.com)Mascot检索比对。结果经过暴皿获得枝孢芽枝菌菌种,其蛋白粗提液SDS-PAGE结果显示有14个条带,含量丰富的有10个条带;Western-Blotting鉴定出18kD的蛋白阳性率达66%,为枝孢芽枝菌的主要过敏原;质谱显示枝孢芽枝菌主要过敏原与约18kD嗜冷杆菌(Psychrobacter arcticum)50S的核糖体蛋白的匹配分值最高。结论采用免疫、质谱法鉴定了枝孢芽枝菌的主要过敏原是约18kD的核糖体蛋白。