基因治疗帕金森病的分子生物学研究：神经营养因子Neurturin基因克隆及其真核表达

目的：克隆中国人Neurturin基因，重组携带Neurturin基因的真核表达载体，为研究Neurturln基因治疗帕金森病提供分子生物学基础。方法：实验于2003—03／2004—05在北京市神经再生修复研究重点实验室完成。采用RT-PCR方法从人胎儿脑中获取Neurturin cDNA，将其克隆至pGEM—Easy—T载体中。测序鉴定后，重组携带Neurturin基因的反转录病毒载体pLPCX-Neurturin；通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系，用病毒上清感染NIH 3T3细胞系以检测病毒滴度。结果：RT-PCR扩增到人Neurturln cDNA片段，序列与Genebank登录的序列一致；将Neurturin基因亚克隆至反转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLPCX-Neurturin，病毒上清滴度为5&;#215;10^4CFU／mL。结论：获得人Neurturln基因cDNA序列，检测到Neurturin基因在真核细胞中表达，并得到较高滴度的病毒上清。     

帕金森病基因治疗的理论：VMAT2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的：获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2，VMAT2)基因，转染至MN9D细胞，通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法：从人胎脑中提取总RNA，RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM—Easy-T载体中，进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2，转染MN9D细胞，免疫细胞化学检测VMAT2的表达，HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果：RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的eDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达；免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)、MAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227．2&;#177;20．8)％和(302．6&;#177;15．7)％(P&;lt;0．01)，而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48．1&;#177;5．3)％和(55．7&;#177;4．9)％(P&;lt;0．05)，细胞内HVA，DOPAC分别升高至(332．1&;#177;28．2)％和(1176．8&;#177;82．5)％(P&;lt;0．01)。结论：克隆了VMAT2cDNA片断，可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促讲多巴胺的循环利用．有望用于帕余森病的基因治疗。     

慢性帕金森病模型猴脑131Ⅰ-epidepride显像研究

多巴胺(DA)系统与帕金森病(PD)发病的机理、治疗及预后关系非常密切。笔者在以前研究基础上,对DA能神经毒素N-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)损毁30个月慢性PD模型猴进行D2受体研究。现报道如下。一、资料与方法Epidepride显像剂前体(江苏省原子医学研究所提供);Picker/MarconixIRIX二探头SPECT仪(Picker公司)。实验     

电针对鼠局灶性脑缺血后脑内Calbindin-D_(28k)表达的影响

针刺治疗脑缺血及其后遗症是中医临床上行之有效的方法之一 ,但其机制仍在探索之中。本课题组前期研究表明 ,电针可明显缓解神经元缺损体征、缩小梗塞性范围 ,其分子机制可能与阻止谷氨酸的兴奋性毒性作用及抑制 i NOS的活性等内源性促凋亡因素有关。Calbindin- D2 8k(Calbindin)可选择性地与Ca2 高亲合性结合。 Calbindin阳性神经元的分布与 L型钙离子通道的分布具有相关性 ,并且 Calbindin阳性神经元在对兴奋性氨基酸及钙离子运载体的反应中 ,Calbindin可下调胞内游离钙水平 ,由此人们推测 Calbindin可通过下调钙离子水平而阻抑 C…     

人DAT基因的克隆及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:探讨人多巴胺(DA)转运体(dopamine transporter,DAT)基因过表达对单胺类递质代谢的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增DAT cDNA片段,重组于pGEM-T-EASY载体中并进行全序列测定。重组真核表达载体pLNCX2-DAT转染MN9D细胞,Western Blot检测DAT的表达,高压液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)法检测细胞内外DA含量的变化。结果:RT-PCR方法扩增得到1981bp的cDNA片段,测序结果表明所得到的片段与DAT序列完全一致;Westein Blot证实转染后的MN9D细胞(实验组)内DAT基因表达明显高于对照组(P0.05);HPLC结果表明实验组中细胞内外的DA含量明显高于对照组(P0.05)。结论:DAT高表达明显促进DA的循环和利用,为帕金森病的基因治疗提供了理论依据。     

帕金森病基因治疗的理论:VMAT2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicular monoamine transporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应.方法从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定.重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化.结果RT-PCR扩增到1 637 bp的带有Kozak序列的cDNA片段.原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)vMAT2免疫着色明显高于对照组.HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P＜0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P＜0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1 176.8±82.5)%(P＜0.01).结论克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达.该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗.     

人胎儿脑室区神经前体细胞的分离纯化、培养及鉴定

目的建立有效的人胎儿神经前体细胞分离及纯化系统。方法取人自然流产胎儿脑室区(VZ)并制备单细胞悬液,采用免疫磁珠法分离CD133阳性及CD133阴性细胞群,体外培养并比较两者增殖能力。用免疫荧光化学方法检测CD133阳性细胞群中神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达及诱导分化后的多向分化潜能。结果纯化后CD133阳性细胞群体外扩增能力强,在无血清培养体系中能形成神经球并可连续传代,免疫荧光化学法检测表明其nestin抗原阳性,诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。而CD133阴性细胞在培养体系中多呈单个分散状态,神经球形成数目与CD133阳性细胞有显著性差异(P<0.05)。结论免疫磁珠法可有效分离人胎儿脑内CD133阳性细胞,且该细胞在体外培养体系中具有神经前体细胞的特征。     

GDNF转基因成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型

为了观察表达胶质细胞系源性神经营养因子 (GDNF)的基因工程细胞在脑内移植后对帕金森病大鼠的治疗作用 ,将 6-羟基多巴胺脑内定位单侧 (损伤侧 )注射制备大鼠帕金森病模型。随机将动物分为实验组 (2 0只 )和对照组 (15只 ) ,分别植入GDNF和 Lac Z转基因的原代培养大鼠成纤维细胞于损伤侧纹状体内 ,动态观察动物单侧旋转行为以及多巴胺及其代谢产物 3 ,4-二羟苯乙酸和高香草酸含量的变化。结果表明 :实验组帕金森病大鼠单侧旋转行为明显减少 ,为移植前旋转圈数的 (64 .8± 5 .8) % (P<0 .0 5 ) ;其纹状体内多巴胺含量显著提高 ,恢复至移植前水平的 (14 .5± 2 .2 ) % (P<0 .0 5 ) ,而对照组仅为 (1.92± 0 .15 ) % ;转基因细胞在脑内可存活 1年以上。本研究结果提示 GDNF基因治疗对大鼠帕金森病具有潜在的临床应用价值。     

人Nurr1基因克隆及其在真核细胞中的表达

为探讨Nurr1基因治疗Parkinson病的可行性,本研究克隆了中国人核相关受体1(nuclearrelatedreceptor1,Nurr1)基因,并重组携带Nurr1基因的真核表达载体,为该研究提供分子生物学基础。实验采用反转录聚合酶链式反应(RTPCR)方法从人胎儿脑中获取Nurr1cDNA,将其克隆至pGEMTEasy载体中;测序鉴定后,重组携带Nurr1基因的逆转录病毒载体pLNCX2Nurr1;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果发现,RTPCR扩增得到人Nurr1cDNA片段,序列与GenBank登录的序列一致;将Nurr1基因亚克隆至逆转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLNCX2Nurr1,病毒上清滴度为2×105CFU/ml。结果表明本实验获得人Nurr1基因cDNA序列,检测到Nurr1基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。     

基因治疗帕金森病的分子生物学研究:神经营养因子Neurturin基因克隆及其真核表达

目的:克隆中国人Neurturin基因,重组携带Neurturin基因的真核表达载体,为研究Neurturin基因治疗帕金森病提供分子生物学基础。方法:实验于2003-03/2004-05在北京市神经再生修复研究重点实验室完成。采用RT-PCR方法从人胎儿脑中获取NeurturincDNA,将其克隆至pGEM-Easy-T载体中。测序鉴定后,重组携带Neurturin基因的反转录病毒载体pLPCX-Neurturin;通过脂质体将重组载体转染PT67包装细胞系,用病毒上清感染NIH3T3细胞系以检测病毒滴度。结果:RT-PCR扩增到人NeurturincDNA片段,序列与Genebank登录的序列一致;将Neurturin基因亚克隆至反转录病毒载体得到插入方向正确的重组载体pLPCX-Neurturin,病毒上清滴度为5×104CFU/mL。结论:获得人Neurturin基因cDNA序列,检测到Neurturin基因在真核细胞中表达,并得到较高滴度的病毒上清。